Información

Sugerencias de muestra para microscopía de contraste de fase


Soy un estudiante no biológico que trabaja en un artículo académico recientemente y me gustaría tener alguna preparación de muestra para el microscopio de contraste de fase.

Para que funcione, imagino que la muestra será:

  • Transparente;

  • Fácil de obtener a partir de productos cotidianos;

  • Fácil de cortar y preparar (es decir, accesible para personas sin formación en biografías).

  • Mejor dimensión alrededor de 10 micros, y se ve bien por debajo de x100.

  • Es preferible que se vea dinámica a temperatura ambiente.

Mis pensamientos actuales son:

  • Humanos: células bucales de la mejilla, frotis de sangre roja, esperma.

  • Plantas: células de la superficie de la cebolla.

  • Otros: levadura, agua de estanque.

¿Alguna otra sugerencia (especialmente las dinámicas)? ¡Gracias!


Cualquier hoja verde y suave de una planta no tóxica es un buen comienzo. Corta una rodaja fina de la hoja (ya sea para mirar la sección transversal o la superficie). Pruebe diferentes hojas con diferentes colores; puede haber colores en el citosol y / o en los cromoplastos.

Ejemplo concreto para estructuras dinámicas:

  • Hojas de Elodea: constan de solo dos capas de células y se pueden mirar bajo el microscopio sin más preparación. Mantenga la hoja en agua y cúbrala con un portaobjetos antes de mirarla bajo el microscopio y agregue agua cuando comience a secarse. Los cloroplastos verdes de las células vegetales se mueven mientras la célula viva.

Puede encontrar Elodea en un estanque o en una tienda que venda peces de acuario y cosas por el estilo. Puede mantener viva la Elodea y cultivarla en agua nutritiva en un lugar soleado.


Contraste microscopico

La mayor parte del detalle de las células vivas es indetectable en la microscopía de campo brillante porque hay muy poco contraste entre estructuras con transparencia similar y no hay suficiente pigmentación natural. Sin embargo, los diversos orgánulos muestran una amplia variación en el índice de refracción, es decir, la tendencia de los materiales a doblar la luz, lo que brinda la oportunidad de distinguirlos.

Una cultura de Amoeba proteus o una nueva suspensión de Nagleria gruberi hacer buenas prácticas.


Microscopía para la bodega

Hay tareas esenciales que todo enólogo debería poder realizar con un microscopio. Primero, debería poder distinguir entre bacterias, levaduras y hongos bajo el microscopio. En segundo lugar, debería poder distinguir los organismos vivos de los desechos (células vegetales, cristales, agentes filtrantes y clarificantes, etc.). En tercer lugar, debe poder identificar los organismos más comunes y fácilmente identificables a simple vista, de modo que pueda saber cuándo se dirige a un problema. Con algo de experiencia, sabrá lo suficiente como para decir que no sabe lo que está creciendo en el vino y tomar medidas o buscar ayuda rápidamente. Hay imágenes de las levaduras, bacterias y mohos más comunes con sus descripciones en este sitio web. Por último, debería poder contar las células de levadura y distinguir entre células vivas y muertas. Estos son algunos de los objetivos por los que nos esforzamos en la clase de laboratorio de Microbiología del vino que se imparte en UC Davis.

Tipos de microscopía: Hay diferentes tipos de microscopios disponibles que varían en precio desde unos pocos cientos de dólares hasta muchos miles de dólares. Por lo general, para una bodega es deseable un visor óptico de buena calidad, uno con contraste de fase es útil para observar las bacterias. La mayoría de los microscopios tienen oculares de 10x y objetivos de 10x a 100x. Esto le dará un rango de aumento de 100x a 1000x. A veces puede obtener oculares de 15x o 20x que pueden aumentar su aumento sin tener que usar un objetivo de 100x. Cualquier objetivo de 100x requiere aceite (inmersión en aceite) para disminuir la refracción de la luz que viaja a través del aire entre la muestra y el objetivo. Esto aumenta efectivamente la resolución de los objetos bajo el microscopio. Un ocular de 20x con un objetivo de 40x le dará un aumento total de 800x sin el uso de inmersión en aceite. Sin embargo, la resolución no es tan buena. Además de los objetivos de 10x, 40x y 100x, algunos osciloscopios pueden tener también objetivos de 4x, 16x o 20x. La siguiente figura muestra Saccharomyces cerevisiae visualizados con diferentes aumentos (100x, 400x, 1000x).

Saccharomyces cerevisiae

100X 400X 1000X

Ahora hay microscopios digitales muy económicos en el mercado que reemplazan el ocular con una pantalla digital similar a la que se encuentra en las cámaras digitales. Los objetivos son los mismos que los de un microscopio estándar, pero a algunas personas les resulta más fácil ver la pantalla que mirar a través de los oculares. El osciloscopio digital permite un zoom digital de hasta 4x pero sin zoom óptico. El zoom digital puede provocar la pixelación de la imagen. Como ocurre con cualquier microscopio, la calidad de la óptica determina la calidad de la imagen y la mayoría de los microscopios digitales no tienen la mejor calidad de óptica. Los mejores microscopios ópticos ahora tienen un tercer puerto óptico para la inserción de una lente de cámara digital. Esto permite que las imágenes se vean en la pantalla de una computadora. El uso de una cámara digital facilita compartir imágenes con colegas y algunos usuarios encuentran la pantalla más fácil de usar que el ocular tradicional.

También existen diferentes tipos de microscopía para fines específicos. El que más le resulte familiar es probablemente la microscopía de campo brillante, que utiliza luz para iluminar un objeto que absorbe luz en áreas más densas para dar contraste para la visualización. La microscopía de campo oscuro excluye la luz no dispersa del campo de visión dejando el fondo oscuro y el objeto en el campo de visión claro. La microscopía fluorescente utiliza una lámpara de mercurio y un filtro para iluminar el campo de visión con luz de una longitud de onda específica. Un segundo filtro filtra esa longitud de onda pero permite que la luz emitida por una molécula excitada pase a través del ocular y sea visualizada. Muchas muestras biológicas, especialmente las fotosintéticas, tienen una gran cantidad de fluorescencia natural, pero más típicamente las muestras se tiñen o etiquetan genéticamente con tintes o etiquetas fluorescentes para permitir la visualización de estructuras o compuestos específicos en las células. La microscopía de contraste de fase y de contraste de interferencia diferencial (DIC) son técnicas que se utilizan para mejorar el contraste de objetos de bajo contraste, especialmente en muestras no fijadas. El uso de un microscopio de contraste de fase o DIC para ver las bacterias hace que sea mucho más fácil para un usuario sin experiencia visualizar las bacterias pequeñas de bajo contraste. En la microscopía de contraste de fase, los cambios de fase en la luz se convierten en brillo en el campo de visión, lo que permite ver estructuras normalmente transparentes. DIC funciona de manera similar, pero utiliza interferometría en lugar de cambios de fase para permitir la visualización de estructuras invisibles en las células. El contraste de fase es más común y menos costoso que el DIC, pero las muestras visualizadas con DIC tienen menos halos de luz que las muestras de contraste de fase. A continuación se muestran fotografías de Oenococcus oeniutilizando campo brillante a 400x, contraste de fase y DIC a 1000x.

Oenococcus oeni

400X Contraste de fase 1000X DIC 1000X

Diferenciar la levadura, las bacterias y el moho: La forma más fácil de diferenciar bacterias, levaduras (hongos unicelulares) y mohos (hongos filamentosos) es generalmente por tamaño. Los mohos son fáciles de ver con un aumento de 100x, la levadura con un aumento de 400x y las bacterias suelen ser difíciles de ver a menos que se amplíe a 1000x. Sin embargo, comparar el tamaño de estos organismos puede resultar difícil sin una referencia. A menudo es más fácil si mezcla cultivos en un solo portaobjetos de microscopio o si ya están mezclados en una muestra de fermentación. Pero hay algunos organismos que se ven comúnmente en la bodega y que no son tan fáciles de distinguir. A continuación se muestra una mezcla de la bacteria común del suelo. Bacillus megaterium y un Lactobacillus de una muestra de vino. Bacillus megateriumes el no vino más común Bacilo que encontramos en los vinos de California y como su nombre lo indica es una bacteria muy grande.

Bacillus megaterium y Lactobacillus sp. Ampliación 1000X

Si bien las bacterias suelen ser mucho más pequeñas que la levadura, Bacillus megaterium es mucho más grande que la mayoría de las bacterias. En la imagen debajo del B. megaterium se ve en comparación con Saccharomyces cerevisiae. Aunque los tamaños son similares, las bacterias son menos refráctiles, más transparentes y difíciles de ver. Esto también es típico de las bacterias frente a las levaduras. La segunda imagen es de un Schizosaccharomyces levadura que se divide por fisión en lugar de brotar. Debido a que las bacterias también se dividen por fisión, una bacteria grande, como B. megaterium, podría confundirse con una levadura de fisión. En el caso de abajo, ambas imágenes tienen el mismo aumento y puede ver que el B. megaterium es más pequeño que las levaduras.

S. cerevisiae y B. megaterium Schizosaccharomyces pombe 1000X

Las levaduras también son más pequeñas que los mohos, que son filamentosos, mientras que las levaduras son unicelulares. Por lo general, esto los hace fáciles de diferenciar, pero hay excepciones. Lo más importante en un entorno vitivinícola son las levaduras, como Brettanomyces bruxellensis, que forman pseudohifas. A continuación se muestra una comparación directa de pseudohifas de Brettanomyces e hifas deBotrytis cinerea. El primer panel es Brettanomyces con un aumento de 1000x y el segundo es Botrytis con un aumento de 100x. losBotrytis es aproximadamente 10 veces más grande que el Brettanomyces.

Brettanomyces bruxellensis 1000x Botrytis cinerea 100 veces

Otro caso en el que puede ser difícil determinar si está viendo levadura o moho es cuando el moho ha formado esporas y ve esporas sueltas. A continuación se muestran algunas fotos de esporas de levadura y moho para comparar.

Metschnikowia pulcherrima - 400X Aspergillus niger
Saccharomyces bayanus a 1000x Botrytis cinerea esporas en maginificación 400x
Candida intermedia a 1000x Fusarium esporas con aumento de 400x

Contando levaduras viables y no viables: (Consulte también "Recuento de células: total y viable") Se puede utilizar un microscopio y algunas herramientas simples para darle una idea del número de células y la viabilidad de su Saccharomyces inóculo. Se puede usar una cámara de recuento simple que se usa para contar células sanguíneas o espermatozoides para determinar el número de células en un volumen dado y se puede usar un colorante azul de metileno para determinar el porcentaje de viabilidad de un inóculo. A continuación se muestra una fotografía de la cuadrícula como la vería bajo el microscopio.

La imagen de arriba tiene un aumento de 100x y las células que se muestran son células de levadura. El cuadrado delimitado por las 3 líneas brillantes es de 0,04 mm cuadrados, 25 de ellos serán de 0,1 mm cuadrados o 0,1 ml de volumen. Cuente suficientes cuadrados para obtener aproximadamente 100 celdas y luego divida el número de celdas por el número de cuadrados contados, multiplique por 25 cuadrados en 0.1 ml y nuevamente por 10 para obtener el número de celdas en 1 mililitro. También debe tener en cuenta cualquier dilución que haya hecho de su inóculo multiplicando por el factor de dilución para obtener la cantidad de células en su muestra original.

El azul de metileno se puede utilizar para estimar el porcentaje de viabilidad de las células en su inóculo. Puede comprar una solución de azul de metileno en la concentración correcta para hacer su recuento. Prepare un portaobjetos de microscopio con 5 ul de colorante y 5 ul de su solución. Cuente 100 células manteniendo un registro de cuántas son azules y cuántas son claras. Las células azules no son viables, no pueden bombear el tinte hacia afuera después de que penetre en su pared celular, y las células claras son viables. El tiempo que las células están en el tinte es importante. Intente contar las células aproximadamente a los 5 minutos después de mezclar el tinte y la suspensión celular. Si cuenta hasta pronto, es posible que el tinte no haya entrado en todas las células. Si espera demasiado, es posible que algunas de las células viables ya no puedan bombear el tinte y se vuelvan inviables. La siguiente imagen muestra el mismo campo de visión a los 2, 5 y 10 minutos. (Ver también "Tinción con azul de metileno")

2 minutos 5 minutos 10 minutos

Distinguir las células vivas de los desechos: La pista más grande de lo que es un organismo biológico y lo que no lo es es la simetría. Los desechos tienden a ser asimétricos, mientras que los organismos vivos son simétricos. Por supuesto, muchas cosas que verá al mirar bajo el microscopio son simétricas y no vivas, como burbujas de aire, cristales y células muertas. Los cristales se identifican fácilmente por su forma geométrica y ángulos agudos. Las burbujas pueden ser más difíciles porque son redondeadas pero carecen de estructura interna y pueden ser de cualquier tamaño. También tienden a crecer a medida que se seca el tobogán. Las células muertas pueden ser más difíciles o imposibles de distinguir de las vivas. Gran parte de los desechos en el mosto son células vegetales y tendrán células unidas pero irregulares en los bordes. Otras partículas que verá son a menudo cosas que se han agregado al vino, como agentes clarificantes o filtrantes. Algunos de estos agentes alguna vez estuvieron vivos y pueden confundirse con células vivas, como las diatomeas fosilizadas que forman la tierra de diatomeas (DE). A continuación se muestran algunas fotografías de cosas que puede ver en fermentaciones y vino que no están vivas.


Tutoriales interactivos

Contraste de fase apodizado

Explore cómo el tamaño de la muestra afecta el ángulo de los rayos de luz difractados que pasan a través de placas de fase apodizada.

Vías ópticas en el microscopio de contraste de fase

Examine las vías de luz a través de un microscopio de contraste de fase y aprenda cómo estos sistemas diseccionan la onda electromagnética incidente en un componente envolvente (S), difractado (D) y de partícula resultante (P).

Alineación del microscopio de contraste de fase

Aprenda a alinear un microscopio de contraste de fase y examine las variaciones en la apariencia de la muestra a través de los oculares (a diferentes aumentos) cuando el anillo del condensador se desplaza y se desalinea con la placa de fase en el objetivo.

Contraste de fase positiva y negativa

Este tutorial interactivo explora las relaciones entre las ondas envolventes (S), difractadas (D) y de partículas resultantes (P) en campo claro, así como microscopía de contraste de fase positiva y negativa.

Artefactos de contraste de fase de sombreado y halo

Explore los artefactos de sombra y halo, donde la intensidad observada no se corresponde directamente con la diferencia de la trayectoria óptica (índice de refracción y valores de espesor) entre la muestra y el medio circundante.

Variaciones de la longitud de la trayectoria óptica de la muestra

Explore los efectos de los cambios en el índice de refracción y el grosor en la longitud de la trayectoria óptica y descubra cómo dos muestras pueden tener diferentes combinaciones de estas variables pero seguir mostrando la misma longitud de trayectoria.


Aplicaciones de la ciencia de la imagen en patología y biología celular

R. Hard,. J.E. Tomaszewski, en Pathobiology of Human Disease, 2014

Microscopio de contraste de fase

Mientras que un microscopio de campo oscuro genera contraste eliminando selectivamente la onda de fondo, un microscopio de contraste de fase detecta los objetos de fase recolectando y luego desplazando selectivamente la fase y absorbiendo la onda de fondo. Inventado por Zernike, esto se logra insertando un anillo de fase de menor diámetro que un anillo de campo oscuro en el plano focal frontal del condensador de contraste de fase ( Figura 9 (a) ). Este anillo se hace coincidir con una "placa de fase" de diámetro similar en el plano focal posterior (BFP) del objetivo. Por lo tanto, los objetivos de diferentes NA deben coincidir con un anillo de fase del tamaño apropiado. Un objetivo de contraste de fase generalmente se codifica con una "P" o "Ph" junto con un color o número que designa qué anillo de fase en el condensador se utilizará con él.

Figura 9. (a) Componentes ópticos de un microscopio de contraste de fase positivo. Estos componentes nuevamente difieren en dos aspectos de los de un microscopio de campo brillante. El diafragma del condensador de la subetapa de un microscopio de campo brillante se reemplaza con un anillo de fase, que bloquea el paso de la luz a través del condensador, excepto la que pasa a través de un anillo de diámetro y ancho fijos que se encuentra en el plano focal frontal del condensador. Este anillo es típicamente de menor diámetro que el de un condensador de campo oscuro. La segunda característica es la placa de fase que se encuentra en el BFP del objetivo. Toda la luz no difractada del objeto se ve obligada a pasar a través de esta placa de fase anular donde se desfasa en un cuarto de longitud de onda con respecto a la luz no difractada que pasa predominantemente a través de la parte de la lente que rodea la placa de fase. Además, una capa absorbente típicamente se recubre por pulverización catódica sobre la fase que también sirve para alterar la intensidad del objeto en relación con la del fondo además de las diferencias de intensidad obtenidas por interferencia de la luz difractada y no difractada en el plano de la imagen primaria. (b) Anillo de fase y placa de fase no coincidentes como se ve en el BFP del objetivo. Para que un microscopio de contraste de fase funcione correctamente, el diámetro del anillo de fase en el condensador debe coincidir con el de la placa de fase en el objetivo. Por lo general, están codificados por colores y numerados para cada objetivo. (c) Además, para tener diámetros coincidentes, las imágenes del anillo de fase (brillante) deben alinearse con precisión usando controles en el condensador de manera que toda la luz no difractada pase a través de la placa de fase donde se desplaza y se absorbe. (d) Aunque toda la luz no difractada pasa a través de la placa de fase, no hay forma de evitar que parte de la luz difractada por el objeto pase también por allí. Esto produce dos artefactos en la imagen del objeto. El primero es un halo de fase brillante en los límites entre estructuras con diferentes índices de refracción. El segundo es el efecto de sombreado o disminución del contraste esperado, que se produce en regiones gruesas. El último efecto varía con el tamaño del objeto, D, como se muestra a lo largo de la z-eje en las huellas adjuntas. Tenga en cuenta estos efectos también en las siguientes imágenes de células de contraste de fase. (e) Imagen de contraste de fase sin procesar, sin procesar y sin realce de un queratinocito de pescado que muestra fibras de retracción que quedan adheridas al sustrato. En esta imagen de ocho bits (256 niveles de gris), estos procesos finos son detectables y distinguibles del fondo y entre sí, como se muestra en el escaneo de líneas indicado por la barra y se muestran sus intensidades representadas en el gráfico adjunto. Observe también el halo de fase pronunciado alrededor de los bordes de la célula donde hay un desajuste del índice de refracción entre la membrana / citoplasma y el fluido de cultivo de tejidos. El efecto de sombreado es evidente por la falta de variación de intensidad esperada del grosor de la celda dentro de su región media. (f) Imagen de contraste de fase positiva mejorada digitalmente de fibras de retracción de células epiteliales pulmonares de anfibios. Estas fibras tienen diámetros & amplt 0,8 μm. 63 × objetivo de inmersión en aceite, 1,4 NA, 0,7 absorbancia, luz blanca.

Como en el campo oscuro, la muestra se ilumina de nuevo con un cono de luz hueco, pero toda la luz de fondo no difractada recogida por el objetivo pasa a través de la placa de fase del objetivo en lugar de eliminarla. Al cambiar de fase y absorber esta luz de fondo en relación con la luz difractada que pasa predominantemente a través de la parte del objetivo externa e interna a la placa de fase, se logra una interferencia entre las dos que da como resultado diferencias de intensidad en el plano de la imagen primaria.

El microscopio se configura nuevamente con iluminación de Köhler, pero falta el diafragma de iris. Entonces, el último paso es observar la BFP del objetivo usando un telescopio de fase insertado en lugar de un ocular o una lente de Bertrand que es parte de la óptica del microscopio. Esto se hace para asegurarse de que el anillo de fase brillante y la placa de fase más oscura sean del mismo tamaño ( Figura 9 (b) ) y correctamente alineado ( Figura 9 (c) ) y que el condensador esté correctamente enfocado de modo que toda la luz no difractada pase a través de la placa de fase oscura.

¿Cómo produce esto contraste? Debido a la dispersión de la luz, la luz difractada se retarda aproximadamente ¼λ en relación con la luz no difractada. Al hacer que la luz no difractada pase a través de la placa de fase, la luz no difractada se desfasa o bien −¼λ o + ¼λ para producir interferencia constructiva o destructiva entre los dos conjuntos de ondas, respectivamente. El primero se denomina contraste de fase negativo y un objeto retardador de fase normalmente aparece brillante sobre un fondo oscuro. Este último se denomina contraste de fase positivo y un objeto retardador de fase normalmente aparece oscuro sobre un fondo más brillante. El contraste real depende del grado de absorbancia de la placa de fase y del desplazamiento de fase producido por el objeto (es decir, su OPD).

Los microscopios de contraste de fase son rápidos y fáciles de configurar y alinear y producen excelentes imágenes. Sin embargo, hay dos artefactos principales que son producidos por la óptica de fase ( Figura 9 (d) ). Ambos resultan de la incapacidad de separar completamente la luz difractada de la no difractada. Aunque la luz no difractada solo pasa a través de la placa de fase, la luz difractada atraviesa tanto el entorno como la placa de fase en sí. El grado de esta mezcla depende del área de la placa de fase (diferencia entre su diámetro interior y exterior) y su tamaño (es decir, su posición en el objetivo). El resultado de esta mezcla es que los bordes de los componentes del objeto tienen un 'halo' artefacto a su alrededor (el efecto de halo de fase) y las intensidades del objeto, como las de una célula de tejido, no varían exactamente como se esperaba con el grosor, es decir, OPD . Este último se denomina "efecto de sombreado".

Los microscopios de contraste de fase se utilizan comúnmente para visualizar células individuales y láminas de células monocapa. Los núcleos, los orgánulos unidos a la membrana, los cromosomas, las miofibrillas, los husos mitóticos, los reticulopodios y otras características celulares se pueden visualizar fácilmente en material vivo y fijo. Estas estructuras también se pueden rastrear en células vivas durante largos períodos de tiempo (con suficiente filtración infrarroja y ultravioleta de la fuente de luz), con poco daño que resulta de las altas intensidades utilizadas y los radicales libres producidos utilizando algunos métodos de fluorescencia. Se muestran ejemplos de imágenes de contraste de fase en Figura 9 (e) y 9 (f) .


Sugerencias de muestra para microscopía de contraste de fase - Biología

La microscopía de contraste de fase y de contraste de interferencia diferencial (DIC) son técnicas complementarias capaces de producir imágenes de alto contraste de fases biológicas transparentes que normalmente no afectan la amplitud de las ondas de luz visible que pasan a través de la muestra. Debido a que las diferencias de fase son indetectables para el ojo humano y no se observan fácilmente en un microscopio con iluminación de campo claro, la trayectoria de la luz a través del microscopio debe modificarse adecuadamente para producir imágenes satisfactorias de las muestras de fase. Muchas técnicas populares de mejora del contraste se basan en la capacidad de las muestras de fase para modificar la diferencia de trayectoria óptica entre las ondas que atraviesan el material biológico y las que atraviesan el medio circundante.

Quizás la distinción más fundamental entre el contraste de interferencia diferencial y la microscopía de contraste de fase es la base óptica sobre la que se forman las imágenes mediante las técnicas complementarias. El contraste de fase produce valores de intensidad de la imagen en función de la magnitud de la longitud de la trayectoria óptica de la muestra, con regiones muy densas (aquellas que tienen grandes longitudes de trayectoria) que aparecen más oscuras que el fondo. Alternativamente, las características de la muestra que tienen un espesor relativamente bajo, o un índice de refracción menor que el medio circundante, se vuelven mucho más claras cuando se superponen sobre el fondo gris medio.

La situación es bastante distinta para el contraste de interferencia diferencial, donde los gradientes de longitud del camino óptico (en efecto, la tasa de cambio en la dirección de la cizalladura del frente de onda) son los principales responsables de introducir contraste en las imágenes de las muestras. Los gradientes pronunciados en la longitud de la trayectoria generan un contraste excelente y las imágenes muestran un sombreado de relieve pseudo tridimensional que es característico de la técnica DIC. Las regiones que tienen pendientes de trayectoria óptica muy poco profundas, como las que se observan en muestras planas extendidas, producen un contraste insignificante y, a menudo, aparecen en la imagen con el mismo nivel de intensidad que el fondo.

Aparte de las diferencias en los mecanismos de formación de contraste, las imágenes de DIC y de contraste de fase difieren en una serie de otras características. En la Figura 1 se ilustran varias imágenes digitales que comparan muestras capturadas en DIC y contraste de fase. En la Figura 1 (a) se presenta una célula epitelial (mejilla) de la mucosa bucal humana, que revela el núcleo, las inclusiones citoplasmáticas y numerosas bacterias en la superficie superior, fotografiada con contraste de interferencia diferencial. El mismo campo de visión con iluminación de contraste de fase se ilustra en la Figura 1 (b). La imagen de contraste de fase presenta halos pronunciados alrededor de la periferia celular y el núcleo, que están ausentes en la imagen de contraste de interferencia diferencial. Las investigaciones de microscopía DIC de corte óptico (no ilustradas) revelan que las bacterias están presentes (casi exclusivamente) en la superficie de la membrana que está bañada en el medio circundante en lugar de estar en la parte inferior de la célula. Este hecho no puede determinarse sin ambigüedades con el contraste de fase.

En la Figura 1 (c), una sección gruesa de tejido de riñón murino fotografiado con contraste de interferencia diferencial revela un haz de células encerradas dentro de un túbulo. Una imagen de contraste de fase (Figura 1 (d)) de la misma área es confusa y perturbada por la presencia de halos de fase fuera del plano de enfoque. Sin embargo, varios de los núcleos celulares aparecen visibles en la imagen de contraste de fase, que no son distinguibles en DIC. En las Figuras 1 (e) y 1 (f) se ilustran vistas de aumento relativamente alto de un perisarco de tallo anulado polipoide de Obelia en DIC y contraste de fase, respectivamente. En DIC, (Figura 1 (e)) la estructura anular aparece hemisférica con rayos internos que emanan radialmente desde el tallo. Además, las partículas granulares son visibles dentro de la estructura del tallo, pero los detalles anatómicos son en gran parte indefinidos. La imagen de contraste de fase (Figura 1 (f)) se confunde con halos alrededor de los anillos anulares y dentro del vástago.

Una ventaja principal del contraste de interferencia diferencial sobre el contraste de fase es la capacidad de utilizar el instrumento a una apertura numérica completa sin los efectos de enmascaramiento de las placas de fase o los anillos del condensador, que restringen severamente el tamaño de las aperturas del condensador y del objetivo. El principal beneficio es la resolución axial mejorada, particularmente con respecto a la capacidad del microscopio DIC para producir excelentes imágenes de alta resolución con grandes tamaños de apertura. En la Figura 2 se ilustran imágenes digitales adquiridas con una lente Bertrand de la apertura posterior del objetivo en microscopios de contraste de interferencia diferencial (Figura 2 (a)) y contraste de fase (Figura 2 (b)). En ambos casos, el objetivo es una fluorita 40x que tiene una apertura numérica de 0,75, y el diafragma de apertura del condensador se abre al tamaño de diámetro más grande. Incluso con el polarizador en su lugar y un prisma Nomarski instalado en el condensador, la apertura del DIC es mucho más grande que la apertura del contraste de fase, principalmente porque el anillo del condensador de fase restringe una porción significativa de la iluminación que normalmente atravesaría el tren óptico del microscopio.

El contraste de fase carece del efecto azimutal pronunciado inherente al contraste de interferencia diferencial, que se manifiesta por la orientación asimétrica de los prismas de Nomarski (o Wollaston modificado) que dividen el haz con respecto al eje óptico y los polarizadores del microscopio. La ausencia de efecto de orientación se produce porque la placa de fase anular en un condensador de microscopio de contraste de fase (Figura 2 (b)) es simétrica rotacionalmente en 360 grados e ilumina la muestra de manera uniforme desde todos los ángulos. Como resultado, la imagen de contraste de fase es independiente de la orientación y no está sujeta a efectos de contraste dependientes de la rotación. Para muchas muestras de las que se obtienen imágenes en contraste de interferencia diferencial, una orientación prerrequisito para lograr el máximo contraste (ya sea en paralelo o perpendicular al eje de corte) restringe la libertad de rotación de la muestra, especialmente para estructuras periódicas lineales o poco espaciadas.

Los efectos de contraste de acimut en el contraste de interferencia diferencial se pueden aprovechar al equipar el microscopio con una platina circular de muestra giratoria de 360 ​​grados. Originalmente diseñadas para observaciones en microscopía de luz polarizada, las etapas circulares permiten al operador rotar la muestra con respecto al eje de cizallamiento del prisma para maximizar o minimizar los efectos de contraste para las características seleccionadas de la muestra. El contraste en la microscopía DIC alcanza un nivel mínimo para las muestras de fase lineal que se extienden a lo largo de la dirección de cizallamiento, pero se puede variar significativamente girando la platina unos pocos grados. Las muestras no lineales, como células, secciones de tejido, partículas y polímeros amorfos, no muestran un efecto azimutal significativo en DIC y, por lo general, se pueden obtener imágenes satisfactoriamente en una variedad de orientaciones.

En la Figura 3 se presentan dos muestras lineales que tienen una cantidad significativa de periodicidad y asimetría en imágenes tanto en contraste de fase como en DIC. En ambos casos, el contraste en las imágenes obtenidas de DIC depende en gran medida de la orientación de la muestra con respecto al eje de corte del microscopio, mientras que las características de la imagen de contraste de fase son independientes de la rotación de la muestra alrededor del eje óptico del microscopio. Las imágenes de las Figuras 3 (a) y 3 (b) se obtuvieron en DIC a partir de una muestra montada de una frústula de diatomea pennada alargada y simétrica bilateralmente. Cuando el eje largo de la diatomea se alinea paralelo al eje de corte del prisma de Nomarski (Figura 3 (a)), se observan fácilmente las crestas y los poros de la frústula. La flecha blanca en la esquina superior derecha de la Figura 3 (a) indica el eje de corte del prisma Nomarski para las imágenes DIC ilustradas en la Figura 3. La rotación de la diatomea 90 grados (perpendicular al eje de corte) reduce el contraste en la imagen de la frústula. y oscurece detalles importantes presentes en la microestructura. Por ejemplo, las crestas longitudinales que se observan fácilmente en los bordes y el centro de la frústula en la Figura 3 (a) están ausentes en la Figura 3 (b). Los efectos de acimut están ausentes en la misma muestra cuando se obtienen imágenes con un sistema óptico de contraste de fase (Figura 3 (c)), que muestra un contraste similar independientemente de la orientación de la muestra. Tenga en cuenta que el contraste de la imagen en la Figura 3 (c) se parece más al mostrado por la imagen DIC en la Figura 3 (b) en lugar de la imagen de alto contraste presentada en la Figura 3 (a). En este caso, los beneficios de los efectos azimutales resultantes de la orientación de la muestra en el contraste de interferencia diferencial son claramente evidentes.

Un segundo ejemplo de efectos de azimut que están presentes en DIC, pero que carecen de contraste de fase, se ilustra en las Figuras 3 (d) a 3 (f). El espécimen es una escama de pez ctenoide semitransparente que contiene inclusiones en forma de diamante que carecen gravemente de contraste y son difíciles de distinguir cuando se superponen sobre las espinas estriadas del cuerpo de la escama. Cuando la escala ctenoidea se orienta con las espinas del cuerpo paralelas al eje de corte en un microscopio DIC (Figura 3 (d)), las inclusiones rectangulares transparentes se vuelven visibles y enmascaran las espinas del cuerpo. La rotación de la platina del microscopio en 90 grados reduce el nivel de contraste de las inclusiones y las espinas estriadas se vuelven claramente visibles (Figura 3 (e)). En contraste de fase (Figura 3 (f)), las inclusiones están presentes con halos acompañantes, así como las espinas estriadas, independientemente de la orientación de la muestra.

La correlación entre el contraste de la imagen y la orientación de la muestra en el contraste de interferencia diferencial a menudo se puede utilizar con ventaja en la investigación de muestras lineales extendidas. Por ejemplo, las estructuras altamente ordenadas en frústulas de diatomeas y especímenes similares pueden superponerse, lo que genera imágenes confusas cuando se observan en contraste de fase y técnicas similares de mejora del contraste. Al capturar imágenes en varias orientaciones, la microscopía DIC a menudo puede presentar una comprensión más clara de la morfología compleja presente en muchas muestras lineales extendidas. Además, cuando la metodología de corte óptico se combina con la obtención de imágenes específicas de azimut, la microscopía de contraste de interferencia diferencial a menudo puede revelar características que son difíciles o imposibles de distinguir utilizando técnicas alternativas.

Artefactos de halo y sombras

Los artefactos de halo y sombra que afectan al sistema óptico de contraste de fase están en gran parte ausentes en las imágenes de contraste de interferencia diferencial. En contraste de fase positivo, las características de la muestra con un índice de refracción más alto que el medio circundante están rodeadas por una franja brillante (halo) que a menudo oscurece los detalles de los bordes. Aunque los halos pueden suprimirse hasta cierto punto mediante modificaciones de configuración al diseño de la placa de fase objetivo, no pueden eliminarse por completo. En algunos casos, las imágenes de contraste de interferencia diferencial sufren de un brillo excesivo a lo largo de los bordes que tienen gradientes ópticos muy pronunciados, pero este efecto suele ocurrir cuando los valores de retardo de polarización son demasiado bajos y se puede evitar mediante el ajuste adecuado del prisma de Nomarski (o de S narmont polarizador del compensador).

La presencia y la gravedad de los halos en el contraste de fase depende, en parte, de la diferencia del índice de refracción entre la muestra y el medio circundante. A menudo, las muestras de contraste de fase contienen una amplia variedad de estructuras que muestran índices de refracción muy fluctuantes, que juntos producen imágenes complejas. Las áreas que tienen un índice de refracción más bajo que el medio circundante exhiben halos oscuros en oposición a los halos brillantes que se pueden observar alrededor de las características de índice de refracción más alto. Los halos surgen debido a los parámetros de configuración del sistema óptico del microscopio de contraste de fase. Una pequeña parte de la luz incidente desviada por la muestra pasa a través de la placa de fase del objetivo debido a la naturaleza esférica de los frentes de onda difractados. Las características más pequeñas de la muestra dan lugar a ángulos de difracción más grandes, pero las estructuras extendidas grandes pueden producir frentes de onda difractados que tienen ángulos menos profundos que a menudo caen dentro de la zona de apertura del objetivo ocupada por las placas de fase.

En la Figura 4 se presenta una comparación entre el contraste de fase y las imágenes DIC con respecto a los artefactos de halo para tres muestras transparentes de imágenes comunes. Los eritrocitos humanos (glóbulos rojos) exhiben un halo distintivo que rodea las células en forma de disco cuando se obtienen imágenes en contraste de fase positivo con aumentos medios y altos (Figura 4 (a)). Tenga en cuenta que la parte central de los discos de eritrocitos es más clara que la periferia debido a una longitud de trayectoria óptica reducida en esta región. Cuando se examina el mismo campo de visión en contraste de interferencia diferencial (Figura 4 (b)), los artefactos de halo que rodean las celdas están ausentes, pero las imágenes adquieren una apariencia de proyección de sombras orientada a lo largo del eje de cizallamiento del prisma de Nomarski (noroeste a sureste), que es manifestado por la parte superior izquierda de las crestas exteriores que son mucho más claras en apariencia que las crestas correspondientes en el lado opuesto (inferior derecha) de las células.

Las células vivas que crecen en cultivo en monocapa se observan con frecuencia y se obtienen imágenes usando microscopía de contraste de fase y de contraste de interferencia diferencial. Varias células HeLa adherentes en cultivo en cubreobjetos de vidrio se ilustran en la Figura 4 (c) con óptica de contraste de fase. Los artefactos de halo rodean la periferia de las membranas celulares y también son evidentes en algunos de los orgánulos más grandes dentro de las células. Aunque muchos de los detalles celulares internos están presentes en alta resolución en esta imagen, la información sobre los contratos intracelulares es suprimida por las regiones brillantes (halo) que aparecen entre las membranas celulares adyacentes. La ausencia de artefactos de halo es evidente en el mismo campo de visión (Figura 4 (d)) cuando se obtienen imágenes con contraste de interferencia diferencial. Los detalles internos de las células son menos evidentes en la CID, pero la periferia de las membranas celulares se visualiza con mayor claridad que con el contraste de fase. De hecho, la proximidad de las células vecinas es muy obvia en la imagen DIC, lo que hace que la técnica sea más precisa para estudiar eventos intercelulares, como la inhibición por contacto.

Los miembros del género de algas verdes filamentosas, Zygnema, exhiben una estructura lineal alargada compuesta de unidades celulares individuales repetidas. En contraste de fase (Figura 4 (e)), los especímenes filamentosos de Zygnema muestran un halo pronunciado que rodea el exterior de los filamentos de algas en forma de varilla, pero también contienen detalles internos sustanciales que están oscurecidos por el artefacto del halo. Las estructuras celulares internas repetidas en forma de U bisimétricas (Figura 4 (e)) dan lugar a grandes halos que reducen significativamente el contraste y enmascaran las características más pequeñas. El contraste de interferencia diferencial elimina los artefactos de halo presentes en las imágenes de contraste de fase de Zygnema (Figura 4 (f)) y revela sustancialmente más detalles internos presentes en el centro del filamento. Sin embargo, para obtener las conclusiones más definitivas con respecto a la estructura del filamento de Zygnema, las dos técnicas de imagen deben aplicarse en conjunto (como es el caso de muchas de las muestras descritas anteriormente).

Como se discutió anteriormente, las características de la muestra que tienen un índice de refracción más alto que el medio circundante muestran halos brillantes alrededor de la periferia y exhiben porciones centrales más oscuras cuando se obtienen imágenes con sistemas ópticos de contraste de fase positivo. El efecto contrario ocurre cuando se observan características que tienen un índice de refracción más bajo que el medio (halos oscuros y regiones internas claras). Los efectos de halo varían con el tamaño de la característica de la muestra y dependen en gran medida del índice de refracción diferencial entre la muestra y el medio circundante. Las diferencias más grandes en el índice de refracción tienden a generar efectos de halo más pronunciados, que también dependen de parámetros instrumentales, como las dimensiones de la placa de fase y la densidad neutra, y el factor de aumento objetivo. Además, el tamaño de la característica de la muestra juega un papel primordial en la determinación de la gravedad de los artefactos de halo en la microscopía de contraste de fase.

La situación es bastante diferente en la microscopía DIC, donde los grandes diferenciales de índice de refracción y el tamaño de la característica de la muestra no afectan la calidad de la imagen. De hecho, las diferencias pronunciadas de índice de refracción entre la muestra y el medio circundante son a menudo muy deseables y, por lo general, conducen a imágenes excelentes en contraste de interferencia diferencial. El tamaño de la característica generalmente no presenta un problema en la microscopía DIC.Las muestras que tienen grandes fluctuaciones en el tamaño y el índice de refracción con frecuencia se pueden obtener imágenes simultáneamente (lado a lado) con sistemas ópticos de contraste de interferencia diferencial para producir estructuras que tienen un contraste excelente, lo que permite observar y reconocer incluso los detalles más pequeños.

Los artefactos de halo y el contraste de la imagen también se ven afectados por el grosor óptico de la muestra en un grado mucho mayor en el contraste de fase que en la microscopía DIC. Con grandes diferencias de trayectoria óptica (hasta la mitad de una longitud de onda), se pueden producir imágenes de contraste de fase ambiguas porque las características más gruesas de una muestra a menudo muestran niveles de contraste muy cercanos o idénticos a los de las características más delgadas. Esto surge de las complejas relaciones entre la longitud del camino óptico (espesor de la muestra e índice de refracción), el contraste y los ángulos de fase. En general, las muestras de contraste de fase ideal no deben tener características que excedan aproximadamente una décima de longitud de onda en la diferencia de trayectoria óptica. Las muestras delgadas también son deseables para la microscopía DIC, pero la técnica es capaz de producir imágenes adecuadas con muestras que tienen valores de espesor (y longitudes de trayectoria óptica) mucho mayores que los recomendados para el contraste de fase. Sin embargo, las muestras muy gruesas pueden influir negativamente en la superposición de los planos de interferencia entre el objetivo y los prismas del condensador, reduciendo la calidad y el contraste en las imágenes DIC.

En muestras planas y extendidas de longitud de trayectoria óptica uniforme, se observa comúnmente un artefacto conocido como sombreado en la microscopía de contraste de fase. El sombreado se manifiesta por la parte central de la muestra que muestra una disminución gradual del contraste hasta que la intensidad se acerca a la del medio circundante. En casos extremos, las muestras extendidas solo serán visibles en contraste de fase debido a la presencia de sus halos. En DIC, solo se produce una variación en la intensidad de la imagen si hay un cambio marcado en la diferencia de la trayectoria óptica, y los límites de las muestras extendidas suelen ser la única característica que se puede reconocer con esta técnica.

Profundidad de campo y seccionamiento óptico

Debido a que las imágenes de contraste de fase pueden volverse ambiguas (o incluso experimentar una inversión de contraste) cuando la longitud de la ruta óptica de la muestra fluctúa en un rango grande, la técnica debe restringirse a muestras que tengan una diferencia de ruta de una décima de longitud de onda o menos, como se discutió anteriormente. . En otras palabras, las muestras gruesas, o las que tienen estructuras en forma de cuña, generalmente no son adecuadas para investigaciones cuantitativas con microscopía de contraste de fase. Las muestras delgadas también tienden a producir imágenes superiores en contraste de interferencia diferencial, pero las muestras más gruesas (que tienen una diferencia de trayectoria óptica entre un décimo y una longitud de onda completa) también pueden obtenerse en aperturas amplias utilizando técnicas de sección óptica.

La apertura de iluminación en contraste de fase se fija por el tamaño del anillo del condensador y no se puede variar para lograr una profundidad de campo aumentada o disminuida. Esta restricción dificulta las observaciones de especímenes que contienen artefactos de halo significativos, que a veces pueden oscurecer las características del espécimen enfocado debido a detalles superpuestos originados por luz excesiva que se origina fuera del plano focal del objetivo. Estos problemas a menudo surgen cuando se intenta obtener imágenes de muestras que son demasiado gruesas para el contraste de fase. Sin embargo, como se discutió anteriormente, la capacidad de sección óptica de la microscopía de contraste de interferencia diferencial (en tamaños de apertura de condensador amplios) permite obtener imágenes excelentes con muestras relativamente gruesas.

Los beneficios de las secciones ópticas de gran apertura a partir de muestras gruesas en contraste de interferencia diferencial se ilustran en la Figura 5, y se comparan con los mismos campos de visión fotografiados con contraste de fase. La Figura 5 (b) ilustra una yema de medusa de un pólipo reproductivo del hidrozoo de Obelia fotografiado con gran aumento en DIC con la apertura del diafragma del iris del condensador ajustada a aproximadamente el 95 por ciento del tamaño de la apertura del objetivo. La delgada sección óptica resultante revela detalles de imagen nítidamente enfocados de las características de la medusa, que solo están mínimamente oscurecidas por la luz que se origina lejos del plano focal. Cuando se examina el mismo campo de visión en contraste de fase (Figura 5 (a)), la imagen de la medusa se ve borrosa por halos y presenta una resolución reducida debido a la apertura restringida del sistema óptico.

En las Figuras 5 (c) a 5 (f) se presentan situaciones similares. La Figura 5 (c) muestra escamas de alas superpuestas de la mariposa monarca (Danaus plexippus), una de las mariposas más comunes en América del Norte. Las escalas individuales no se pueden distinguir en la Figura 5 (c) debido a los artefactos de halo y las características indistintas que no están en el plano de enfoque. En general, la imagen se confunde con numerosos artefactos, lo que hace que las características del espécimen sean difíciles de descifrar. La obtención de imágenes de la misma muestra en contraste de interferencia diferencial (Figura 5 (d)) elimina muchos de los artefactos que distraen colocados lejos del plano focal y delimita claramente las características de la superficie en una sola escala de ala. Del mismo modo, un paquete de huevos dentro del abdomen de una tenia canina del pepino (Dipylidium caninum) revela bordes afilados que rodean los huevos individuales cuando se obtienen imágenes en DIC (Figura 5 (f)). Sin embargo, los huevos enfocados carecen de una estructura distintiva en contraste de fase (Figura 5 (e)), principalmente debido a los halos de otros huevos situados lejos del plano focal.

La capacidad de sección óptica del contraste de interferencia diferencial en grandes tamaños de apertura del condensador y alta apertura numérica es fundamental para obtener imágenes de planos focales únicos en muestras de fase gruesa. Los detalles y la luz parásita de las características que se encuentran fuera del plano focal inmediato no comprometen las imágenes DIC de la misma manera que las imágenes de contraste de fase, que a menudo se complican por los artefactos de halo. Como resultado, el contraste de interferencia diferencial se puede emplear para obtener imágenes excelentes en condiciones algo desfavorables (muestras muy gruesas), incluso cuando una gran profundidad de campo imposibilita la identificación de estructuras de fase en microscopía de contraste de fase debido a detalles superpuestos.

Una ventaja del contraste de fase sobre la DIC es la capacidad de obtener imágenes con éxito de muestras dicroicas y birrefringentes. Debido a que los sistemas ópticos de contraste de interferencia diferencial dependen de la luz polarizada para establecer la orientación de los campos de frente de onda, la absorción diferencial de ondas ordinarias y extraordinarias por una muestra birrefringente o dicroica conduce a imágenes confusas. El contraste de fase no requiere el uso de luz polarizada y está libre de perturbaciones ópticas generadas por muestras birrefringentes.

Una de las principales preocupaciones relacionadas con los artefactos de birrefringencia en la microscopía de contraste de interferencia diferencial surge del uso generalizado de recipientes de cultivo de tejidos de plástico. El estrés inherente a la estructura del recipiente de polímero moldeado produce una birrefringencia excesiva que despolariza la luz y confunde la interpretación de las imágenes DIC. Por tanto, las células vivas que crecen en estos contenedores no pueden formarse imágenes satisfactoriamente con contraste de interferencia diferencial y, en cambio, normalmente se observan y fotografían con sistemas ópticos de contraste de fase o de contraste de modulación de Hoffman.

Los artefactos típicos que surgen de la obtención de imágenes de muestras birrefringentes en CID se presentan en la Figura 6, junto con imágenes de campos de visión idénticos en contraste de fase. Los gránulos de almacenamiento de almidón (que aparecen como glóbulos) de una sección delgada teñida cuádruple de tejido de papa (Solanum tuberosum), que también ilustra una porción del tubérculo maduro con peridermo, corteza y tejidos vasculares reducidos, se presentan en las Figuras 6 (a) y 6 (b). Debido a que los carbohidratos en los granos de almidón de papa exhiben una estructura molecular laminar ordenada, porciones de los granos (y en algunos casos, todo el grano en sí) son birrefringentes y absorben los frentes de onda polarizados que salen del prisma Nomarski del condensador y pasan a través de la muestra. Como resultado, los granos de almidón de patata observados en microscopía DIC exhiben colores de interferencia y los patrones característicos de la cruz de Malta (que se originan en los polarizadores cruzados), que son típicos de las muestras anisotrópicas birrefringentes que tienen simetría esférica (Figura 6 (b)). El artefacto de birrefringencia en DIC enmascara gran parte de la estructura interna de los granos de almidón, que revelan muchos más detalles cuando se obtienen imágenes en contraste de fase (Figura 6 (a)), a pesar de que la muestra ha sido teñida.

En la Figura 6 (c) se ilustra una imagen de contraste de fase de una única fibra de rayón que muestra la morfología picada que está presente tanto en la superficie como en el interior del polímero. El rayón se fabrica a partir de celulosa, borras de algodón o astillas de madera tratando los materiales a granel con hidróxido de sodio y disulfuro de carbono y luego pasando la solución viscosa resultante a través de hileras. Las fibras producidas en este proceso tienen un orden de largo alcance y suelen ser muy birrefringentes. El examen DIC (Figura 6 (d)) de la fibra de rayón confirma el carácter birrefringente, que se manifiesta en los colores de interferencia newtonianos presentes en la imagen. Los colores, aunque hermosos, oscurecen los detalles de la muestra y disminuyen la utilidad de DIC para obtener imágenes de materiales de este tipo. Las imágenes birrefringentes ilustradas en las Figuras 6 (b) y 6 (d) se registraron utilizando muestras relativamente delgadas (5-20 micrómetros) con un aumento bajo (20x) que permanecen en un enfoque nítido en todo el campo de visión. Cuando se obtienen imágenes de muestras birrefringentes más gruesas con DIC, los colores de interferencia que se originan en planos alejados del punto de enfoque tienden a oscurecer los detalles de la muestra en un grado mucho mayor. Por lo tanto, a medida que aumenta el grosor de la muestra (para muestras birrefringentes), las imágenes resultantes producidas en DIC tienden a perder contraste y la calidad se deteriora rápidamente.

Los problemas asociados con la observación de células vivas cultivadas en recipientes de cultivo de tejidos de plástico usando microscopía de contraste de interferencia diferencial son claramente evidentes al comparar las Figuras 6 (e) y 6 (f). En la Figura 6 (e) se ilustran varias células de fibroblastos de piel de venado Muntjac indio (Muntiacus muntjak) en cultivo en monocapa, fotografiadas usando una combinación de condensador y objetivo de larga distancia de trabajo en contraste de fase en un microscopio de cultivo de tejido invertido. Las células se cultivaron en recipientes de poliestireno moldeado que tenían un grosor de pared superior e inferior de aproximadamente 1,2 milímetros cada uno (el grosor combinado del poliestireno es 2,4 milímetros). Incluso con los objetivos de contraste de fase que tienen collares de corrección que están diseñados para la observación a través de vidrio grueso o plástico, la calidad de la imagen sufre cuando se compara con las células obtenidas en placas de vidrio de cobertura delgadas (170 micrómetros) (compare la Figura 6 (e) con la Figura 4 (c) ). Sin embargo, gran parte del detalle celular interno todavía es visible, incluidos los núcleos, el nucleolo, las vacuolas y numerosas partículas más pequeñas.

En contraste de interferencia diferencial, las células de fibroblastos de Indian Muntjac cultivadas ilustradas en la Figura 6 (e) pierden una cantidad significativa de contraste (Figura 6 (f)) debido a los efectos de absorción e interferencia del recipiente de poliestireno birrefringente. Debido a que las paredes del recipiente son relativamente gruesas, la birrefringencia de deformación despolariza los frentes de onda ordinarios y extraordinarios en la pared superior del recipiente de cultivo de tejidos antes de que atraviesen las células y una vez más después de salir de las células y atravesar la pared inferior. El resultado es una caída en el contraste tan severa que las células solo pueden ser captadas cuando el diafragma del condensador está casi completamente cerrado (similar a las técnicas de campo claro con muestras transparentes). En estas condiciones, las imágenes muestran numerosos artefactos de difracción además del bajo contraste, y hacen que DIC sea prácticamente inútil para este tipo de observación.

La principal fuente de errores en el examen de muestras birrefringentes con microscopía de contraste de interferencia diferencial surge de la necesidad de usar luz polarizada, como se discutió anteriormente. En las muestras birrefringentes, los frentes de onda ortogonales polarizados (ordinarios y extraordinarios) se absorben en diferentes grados, dependiendo de su orientación con respecto a las moléculas anisotrópicas dentro de la muestra. Como resultado, cuando los frentes de onda ortogonales se recombinan en el prisma objetivo de Nomarski y pasan al analizador, interfieren con diferente intensidad. La imagen final, por lo tanto, no es solo una función de la diferencia de trayectoria óptica experimentada por los dos frentes de onda (normalmente un factor crítico en DIC), sino también las amplitudes diferenciales de los dos haces inducidos por la muestra. El efecto sobre las imágenes es similar a una configuración de microscopio en la que los ejes de transmisión del polarizador y el analizador no son perfectamente perpendiculares (en efecto, ligeramente sin cruzar). Debido a que el contraste de fase no depende de la luz polarizada, la técnica está en gran parte libre de artefactos inducidos por muestras birrefringentes.

Las muestras de amplitud ligeramente teñidas, que no son necesariamente birrefringentes pero pueden retener una cantidad significativa de carácter de gradiente de fase, experimentan una intensidad reducida debido a la absorción de longitudes de onda visibles por la placa de fase objetiva en la microscopía de contraste de fase. Sin embargo, estas muestras a menudo pueden producir resultados satisfactorios en contraste de interferencia diferencial cuando están presentes gradientes de trayectoria óptica sustanciales y ambos frentes de onda polarizados se absorben por igual. De hecho, la tinción selectiva de orgánulos intracelulares (por ejemplo, núcleos intactos y cromosomas en metafase) se puede acoplar a la formación de imágenes con microscopía DIC para mejorar el detalle de la muestra y segregar los eventos que ocurren en el momento en que se fijaron las células.

En la Figura 7 se ilustran varios ejemplos de muestras teñidas con cromóforos biológicos comunes (que absorben luz visible), y se obtienen imágenes con contraste de fase y microscopía DIC. En la Figura 7 (a) se presenta una sección delgada de tejido adiposo teñido con grasa humana observado en contraste de interferencia diferencial, y en la Figura 7 (b) el mismo campo de visión con contraste de fase. La imagen de contraste de fase es confusa y carece de resolución de detalles finos, principalmente debido a los artefactos de halo que enmascaran las ventajas de la tinción biológica. El contraste de fase claramente no es apropiado para recuperar información significativa de esta muestra. En distinción, una imagen DIC correspondiente del mismo espécimen (Figura 7 (a)) muestra los glóbulos de grasa en un relieve pseudo tridimensional proyectado en sombras, lo que los distingue bastante bien de otras características de la imagen.

El mismo efecto se observa con microscopía DIC en la Figura 7 (c), donde los núcleos meióticos y cromosomas teñidos diferencialmente dentro de una sección delgada de testículos de rana se pueden observar en alto contraste. Esta imagen se beneficia de la aplicación inteligente de múltiples tintes que ayudan a segregar cromáticamente el material genético de otros componentes intracelulares. De hecho, la muestra proporciona información más significativa cuando se obtiene una imagen en DIC que en el modo de observación del objetivo de iluminación de campo claro. El mismo campo de visión en contraste de fase (Figura 7 (d)) se confunde con halos que rodean los componentes intracelulares densamente teñidos, que son mucho más difíciles de distinguir en este modo de imagen. Existe una situación similar para una sección delgada teñida de un diente de mamífero que se presenta en las Figuras 7 (e) y 7 (f). En la CID, las laminillas estriadas en el esmalte son fáciles de observar debido a su relieve (Figura 7 (e)), mientras que las diferencias de trayectoria óptica menos que óptimas acopladas a la tinción excesiva enmascaran estas estructuras en contraste de fase (Figura 7 (f)). Los ejemplos de la Figura 7 proporcionan una fuerte evidencia de que el contraste de interferencia diferencial es una técnica adecuada para observar muestras levemente teñidas, aunque las mismas muestras son difíciles de obtener imágenes en contraste de fase.

La diferencia más obvia entre DIC y microscopía de contraste de fase son las imágenes de proyección de sombras pseudo tridimensionales formadas por sistemas ópticos de contraste de interferencia diferencial. Las imágenes de las muestras se reproducen de una manera que recuerda las técnicas de sombreado utilizadas durante muchos años en microscopía electrónica, que proporcionan información sobre las propiedades topográficas de la muestra. Sin embargo, en DIC, las colinas y valles aparentes en las imágenes no deben confundirse con una indicación del perfil topográfico real en el espécimen y siempre deben interpretarse con precaución. El contraste de fase no produce imágenes que tengan un carácter tridimensional significativo.

Muchas de las similitudes y diferencias entre el contraste de fase y la microscopía de contraste de interferencia diferencial se resumen en la Tabla 1 para una serie de variables, incluido el brillo de la imagen, la resolución, las limitaciones de cambio de fase, los artefactos, las características de la muestra y el costo. En resumen, el brillo de la imagen tanto en contraste de fase como en DIC es mucho menor (solo un pequeño porcentaje) que la observación de campo claro ordinario, pero estas técnicas de mejora del contraste son capaces de proporcionar imágenes mucho más definidas. La iluminación es más crítica para la microscopía DIC que el contraste de fase, especialmente cuando se utilizan polarizadores de baja transmisión con grandes aumentos. A menudo, se requiere una lámpara de descarga de arco de mercurio o tungsteno-halógeno de 100 vatios para obtener imágenes satisfactorias, mientras que los microscopios de contraste de fase funcionan adecuadamente con lámparas incandescentes de 50 vatios. La resolución lateral (x-y) y axial (z) en la microscopía de contraste de interferencia diferencial excede dramáticamente a la del contraste de fase, que exhibe una resolución modesta o pobre en ambas dimensiones a pesar de que el límite de detección de desplazamiento de fase es similar en ambos casos.

Características de la microscopía de contraste de fase y DIC
Característica Contraste de fase DIC
Brillo de imagen
(Campo claro = 100 por ciento)
1.3 por ciento 0,36 - 2,3 por ciento
Pérdida de luz por epifluorescencia
(Campo claro = 0 por ciento)
28 por ciento 73 por ciento
Resolución lateral Condensador
Anillo
Restringido
Superior
Resolución axial
(Discriminación de profundidad)
Pobre Superior
Apertura iluminadora 10 por ciento de
Objetivo NA
Variable
Cambio de fase
Límite de detección
& lt l / 100 & lt l / 100
Utilidad en grandes cambios de fase Inútil Útil
Efectos azimutales No
Halos y sombras No
Muestras teñidas Inútil Útil
Especímenes birrefringentes Útil Inútil
Muestra birrefringente
Contenedores
No
Imagen de campo claro
Deterioro
Leve Ninguno
Costo Moderar Elevado
Tabla 1

Las muestras de fase gruesa que tienen grandes diferencias en la trayectoria óptica pueden formarse fácilmente imágenes en contraste de interferencia diferencial usando técnicas de sección óptica, pero a menudo son difíciles de obtener imágenes con contraste de fase debido a artefactos de halo. Otros factores, como los efectos azimutales y la capacidad de obtener imágenes de muestras teñidas en DIC, ayudan a compensar las dos técnicas. El contraste de fase es mucho más útil para las observaciones de rutina en los laboratorios de cultivo de tejidos, donde la obtención de imágenes de células vivas en recipientes de cultivo de plástico es una actividad diaria. Alternativamente, la información de alta resolución se recupera mejor utilizando métodos de contraste de interferencia diferencial (a menudo acoplados a video de lapso de tiempo) para imágenes de células en vivo. En general, DIC requiere más habilidades técnicas para configurar y operar, incluido el complejo proceso de alineación, la manipulación continua del enfoque de la muestra, el ajuste del diafragma de apertura del iris, la orientación de la muestra y el desplazamiento lateral del prisma Nomarski objetivo para lograr un contraste óptimo.Los microscopios de contraste de fase son mucho más fáciles de alinear y operar, y pueden ser utilizados con bastante eficacia por microscopistas relativamente inexpertos.

El contraste de fase generalmente tiene una utilidad limitada para obtener imágenes de muestras de fase transparente que tienen un contraste deficiente. Por el contrario, la microscopía DIC se puede emplear tanto para muestras teñidas como no teñidas, pero adolece de artefactos cuando se encuentran características birrefringentes. Se obtiene más control sobre el contraste de la muestra al traducir el prisma objetivo (o compensador de S narmont) en DIC, que se puede ajustar en una amplia gama de posiciones para lograr diferentes niveles de colores de interferencia en escala de grises, o efectos de tinción óptica multicolor en grandes diferencias de camino. Además, el diafragma de apertura del condensador también se puede ajustar en DIC para alterar el contraste y la resolución de la muestra. El contraste de fase se limita al contraste proporcionado por el diafragma anular del condensador y la placa de fase del objetivo alojada en el objetivo. Prácticamente no es posible realizar ningún ajuste de contraste (aparte del intercambio de placas de fase) con la microscopía de contraste de fase.

Entre las consideraciones más importantes en muchos laboratorios, al comparar DIC y contraste de fase, se encuentra el costo de los componentes accesorios. Debido a que DIC requiere varios prismas Nomarski birrefringentes costosos y elementos ópticos libres de tensión (objetivos y condensador), la instrumentación es significativamente más costosa que los componentes de contraste de fase. En muchos casos, particularmente cuando la fotomicrografía y / o la imagen digital no es una consideración principal, el contraste de fase a menudo servirá para los propósitos de un laboratorio. Sin embargo, cuando se deben obtener imágenes de alta resolución a partir de células y tejidos vivos, o muestras similares de fase transparente frágil, el contraste de interferencia diferencial es la técnica de elección.

En general, la microscopía de contraste de fase y de contraste de interferencia diferencial debe considerarse como técnicas complementarias (en lugar de competidoras) y emplearse juntas para investigar completamente las propiedades ópticas, la dinámica y la morfología de la muestra. La introducción de objetivos de contraste de fase modernos que tienen placas de fase de densidad neutra más baja permite al microscopista, en muchos casos, utilizar un solo conjunto de objetivos para imágenes de campo claro, fluorescencia, contraste de fase y DIC.

Douglas B. Murphy - Departamento de Biología Celular y Anatomía e Instalación de Microscopio, Facultad de Medicina de la Universidad Johns Hopkins, 725 N. Wolfe Street, 107 WBSB, Baltimore, Maryland 21205.

Jan Hinsch - Leica Microsystems, Inc., 90 Boroline Road, Allendale, Nueva Jersey, 07401.

Kenneth R. Spring, consultor científico, Lusby, Maryland, 20657.

Michael W. Davidson - Laboratorio Nacional de Alto Campo Magnético, 1800 East Paul Dirac Dr., Universidad Estatal de Florida, Tallahassee, Florida, 32310.


Reseñas / guías de microscopios de contraste de fase de MicroscopeMaster

Conclusión

los microscopio de contraste de fase abrió todo un mundo de microscopía, proporcionando una definición y claridad increíbles de partículas nunca antes vistas.

Estos ejemplares transparentes no se pudieron explorar porque no tienen la capacidad de absorber luz.

Zernike encontró una manera de manipular los caminos de la luz mediante el uso de anillos colocados estratégicamente y su sistema es un elemento básico de la mayoría de los microscopios modernos.

Aunque existen algunas desventajas, como la sombra y las distorsiones de halo, el contraste de fase proporciona imágenes muy detalladas y bien contrastadas.

El avance más importante es la capacidad de observar partículas vivas en estado natural.

Para obtener más información sobre las técnicas disponibles, siga adelante y lea sobre otras técnicas de obtención de imágenes microscópicas.


La microscopía de campo oscuro se utiliza idealmente para iluminar muestras no teñidas, lo que hace que parezcan iluminadas sobre un fondo oscuro. Este tipo de microscopio contiene un condensador especial que dispersa la luz y hace que se refleje en la muestra en ángulo. En lugar de iluminar la muestra con un cono de luz lleno, el condensador está diseñado para formar un cono de luz hueco. La luz en el vértice del cono se enfoca en el plano de la muestra a medida que esta luz pasa por el plano de la muestra y se propaga nuevamente en un cono hueco. La lente del objetivo se encuentra en el hueco oscuro de este cono, aunque la luz viaja alrededor y más allá de la lente del objetivo, no entran rayos.

Figura: Visualización de bacterias vivas: Bacterias espiroquetas observadas bajo microscopía de campo oscuro.

Todo el campo aparece oscuro cuando no hay muestra en la platina del microscopio, de ahí el nombre de microscopía de campo oscuro. Cuando una muestra está en el escenario, la luz en el vértice del cono la golpea. Los rayos esparcidos por la muestra y capturados en la lente del objetivo forman así la imagen.

Las muestras observadas con microscopía de campo oscuro deben prepararse cuidadosamente, ya que el polvo y otras partículas también dispersan la luz y se detectan fácilmente. Los portaobjetos de vidrio deben limpiarse a fondo de polvo y suciedad extraños. Puede ser necesario filtrar los medios de muestra (agar, agua, solución salina) para excluir contaminantes confusos. Los materiales de muestra deben esparcirse en una capa fina, demasiado material en el portaobjetos crea muchas capas y bordes superpuestos, lo que dificulta la interpretación de las estructuras.

La microscopía de campo oscuro tiene muchas aplicaciones en microbiología. Permite la visualización de bacterias vivas y distingue alguna estructura (varillas, varillas curvas, espirales o cocos) y movimiento.


Sugerencias de muestra para microscopía de contraste de fase - Biología

Charlotte K. Omoto *
* Departamento de Genética y Biología Celular

Joan Folwell #
#Departamento de Zoología

Universidad Estatal de Washington
P. O. Box 644234
Pullman, WA 99164-4234
Voz: (509) 335-5591
Fax: (509) 335-1907

INTRODUCCIÓN

La microscopía óptica es una herramienta de investigación importante para la biología que se utiliza con regularidad en las escuelas secundarias y universidades. La estructura de muchas muestras biológicas es de bajo contraste que no puede ser revelada por los microscopios compuestos de campo claro que se proporcionan en muchas aulas. Los microscopios que mejoran el contraste de estas muestras a través de ópticas especiales son prohibitivamente costosos para la mayoría de los presupuestos de enseñanza. Este artículo describe una modificación simple y económica que convierte un microscopio de campo claro en un microscopio de campo oscuro que permite examinar muestras de bajo contraste. Este artículo explica la teoría básica de la microscopía de campo oscuro. Se presentan fotografías que comparan la aplicación de campo claro y campo oscuro. Esta técnica permite un uso ampliado del microscopio de campo claro en todos los niveles de enseñanza con muy poca manipulación o gasto.

Teoría de la microscopía de campo oscuro

Los microscopios se utilizan para ampliar objetos. A través de la ampliación, se hace que una imagen parezca más grande que el objeto original. El aumento de un objeto se puede calcular aproximadamente multiplicando el aumento de la lente del objetivo por el aumento de la lente ocular. Los objetos se amplían para poder ver pequeños detalles. No hay límite para el aumento que se puede lograr, sin embargo, hay un aumento más allá del cual los detalles no se vuelven más claros. El resultado se denomina aumento vacío cuando los objetos se hacen más grandes pero sus detalles no se vuelven más claros. Por lo tanto, no solo la ampliación, sino también la resolución son importantes para la calidad de la información en una imagen.

El poder de resolución del microscopio se define como la capacidad de distinguir dos puntos entre sí. La resolución de un microscopio depende de varios factores en su construcción. También existe un límite teórico inherente a la resolución impuesto por la longitud de onda de la luz visible (400-600 nm). El límite teórico de resolución (la distancia más pequeña que se puede ver entre dos puntos) se calcula como:

donde l representa la longitud de onda de la luz utilizada y N.A. es la apertura numérica. Los microscopios para estudiantes generalmente tienen una resolución mucho más baja que el límite teórico debido a lentes y sistemas de iluminación de menor calidad.

La microscopía de campo claro estándar se basa en la luz de la fuente de la lámpara que se recoge en el condensador de la subplaca y se forma en un cono cuyo vértice se enfoca en el plano de la muestra. Los especímenes se ven debido a su capacidad para cambiar la velocidad y la trayectoria de la luz que los atraviesa. Esta capacidad depende del índice de refracción y la opacidad de la muestra. Para ver una muestra en un microscopio de campo claro, los rayos de luz que lo atraviesan deben cambiarse lo suficiente para poder interferir entre sí, lo que produce un contraste (diferencias en las intensidades de luz) y, por lo tanto, construir una imagen. Si la muestra tiene un índice de refracción demasiado similar al medio circundante entre la platina del microscopio y la lente del objetivo, no se verá. Para visualizar bien los materiales biológicos, los materiales deben tener este contraste inherente causado por los índices de refracción adecuados o estar teñidos artificialmente. Estas limitaciones requieren que los instructores encuentren materiales de alto contraste de forma natural o que mejoren el contraste tiñéndolos, lo que a menudo requiere matarlos. No es posible visualizar adecuadamente materiales vivos transparentes o muestras delgadas sin teñir con un microscopio de campo claro.

La microscopía de campo oscuro se basa en un sistema de iluminación diferente. En lugar de iluminar la muestra con un cono de luz lleno, el condensador está diseñado para formar un cono de luz hueco. La luz en el vértice del cono se enfoca en el plano de la muestra a medida que esta luz pasa por el plano de la muestra y se propaga nuevamente en un cono hueco. La lente del objetivo se encuentra en el hueco oscuro de este cono, aunque la luz viaja alrededor y más allá de la lente del objetivo, no entran rayos (Fig. 1). Todo el campo aparece oscuro cuando no hay muestra en la platina del microscopio, de ahí el nombre de microscopía de campo oscuro. Cuando una muestra está en el escenario, la luz en el vértice del cono la golpea. La imagen está hecha solo por aquellos rayos dispersos por la muestra y capturados en la lente del objetivo (observe los rayos dispersos por la muestra en la Figura 1). La imagen aparece brillante contra el fondo oscuro. Esta situación se puede comparar con la apariencia brillante de las partículas de polvo en una habitación oscura iluminada por fuertes rayos de luz que entran por una ventana lateral. Las partículas de polvo son muy pequeñas, pero se ven fácilmente cuando dispersan los rayos de luz. Este es el principio de funcionamiento de la microscopía de campo oscuro y explica cómo se crea la imagen de material de bajo contraste: un objeto se verá sobre un fondo oscuro si dispersa la luz que se captura con el dispositivo adecuado, como una lente de objetivo.

Los microscopios de campo oscuro de la más alta calidad están equipados con costosos condensadores especializados construidos solo para aplicaciones de campo oscuro. Sin embargo, este efecto de campo oscuro se puede lograr en un microscopio de campo claro mediante la adición de una simple "parada". El tope es una pieza de material opaco que se coloca debajo del condensador de la subplaca; bloquea el centro del haz de luz que proviene de la base del microscopio y forma el cono hueco de luz necesario para la iluminación de campo oscuro.

Procedimientos

    Carl Zeiss Estados Unidos
    División de microscopía
    1-800-233-2343
    (pregunte por el nombre y número del representante local)

Si un tope de campo oscuro fabricado no está disponible para sus microscopios, existen algunas alternativas. Si hay un portafiltros debajo del condensador, es posible que un tope de campo oscuro de otra compañía se ajuste o se haga a la medida. Se puede montar una moneda o un círculo de otro material opaco en el centro de un disco transparente, por ejemplo, vidrio, e insertarlo. También se puede hacer un tope perforando un círculo de cartulina negra, el círculo se adhiere a la parte inferior del condensador con cinta adhesiva doble. Esta alternativa puede ser un poco complicada porque el material debe colocarse en el centro del condensador y el condensador debe limpiarse cuando se retira la cinta. Técnicamente, para bloquear correctamente el haz, el tope debe variar en diámetro de 8 mm a 20 mm dependiendo del aumento y la apertura numérica de la lente del objetivo.

La microscopía de campo oscuro reduce la cantidad de luz que ingresa al sistema de lentes de un microscopio de dos maneras. Primero, el tope bloquea el centro del haz de luz que de otra manera llenaría la lente del objetivo. En segundo lugar, solo se ve la luz que es dispersada por la muestra y entra en la lente del objetivo. Por lo tanto, el mejor resultado de visualización requiere aumentar la intensidad de la luz tanto como sea posible: estableciendo el ajuste de intensidad de la luz al máximo, abriendo el diafragma de campo, abriendo la apertura del condensador y eliminando cualquier color u otros filtros. También se deben utilizar los portaobjetos de microscopio correctos, que deben tener un grosor de 1 mm.

La iluminación debe alinearse y ajustarse para lograr la mejor imagen. Antes de realizar la modificación del campo oscuro, alinee el haz de luz en el centro del campo de visión de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Para facilitar el enfoque del condensador de la subplaca y la lente del objetivo, use un portaobjetos lleno de muestras en las que es fácil encontrar instrucciones para hacer un portaobjetos de células de la mejilla. Enfoque el portaobjetos de muestra con un aumento bajo (10X) en el modo de campo claro. Inserte el tope de campo oscuro sin cambiar el enfoque. Asegúrese de que haya la máxima cantidad de luz disponible. Suba el condensador a su posición más alta con la perilla de enfoque del condensador. Mire la muestra y baje lentamente el condensador hasta que la muestra sea visible sobre un fondo oscuro y con el contraste más nítido. Finalmente, ajuste la vista de la imagen con la perilla de enfoque fino.

Limitación de la microscopía de campo oscuro

La ventaja de la microscopía de campo oscuro también se convierte en su desventaja: no solo la muestra, sino también el polvo y otras partículas dispersan la luz y se observan fácilmente. Por ejemplo, no solo las células de las mejillas, sino también las bacterias en la saliva son evidentes en la Figura 2D. Es necesario tener más cuidado en la preparación de muestras en aplicaciones de campo oscuro. Los portaobjetos de vidrio deben limpiarse a fondo de polvo y suciedad extraños. Puede ser necesario filtrar los medios de muestra (agar, agua, solución salina) para excluir contaminantes confusos. Los materiales de muestra deben esparcirse en una capa fina, demasiado material en el portaobjetos crea muchas capas y bordes superpuestos que dificultan la interpretación de las estructuras.

Para crear la imagen, esta técnica se basa en la luz dispersa de las muestras. Falta de color o es mínimo, esto puede ser decepcionante para el espectador. El tamaño real de las muestras también se ve afectado y el ancho de los objetos se vuelve exagerado.

Ejemplos de imágenes de campo oscuro.

La Figura 2 compara las imágenes de Chlamydomonas vivas, un alga biflagelada en los modos de campo claro y campo oscuro. Aunque las células se ven con campo claro, los flagelos no son discernibles (Fig. 2B). Se puede lograr algo de contraste cerrando el diafragma de apertura del condensador que luego permite ver los flagelos (Fig. 2A). Sin embargo, cerrar la apertura del condensador disminuye la apertura numérica de la lente del objetivo, reduciendo efectivamente la resolución. Darkfield permite que los flagelos y los detalles del interior se vean claramente (Fig. 2C). Por tanto, el uso de microscopía de campo oscuro consigue tanto un alto contraste como una alta resolución.

Las células de las mejillas hacen un estudio rápido. Las células bucales se obtienen raspando suavemente el interior de la boca con un palillo de dientes y esparciendo las células en un portaobjetos, se coloca un cubreobjetos sobre la preparación que no se deja secar. Estas células no tienen un contraste inherente y son difíciles de ver con un campo claro. En un microscopio de campo oscuro se logra un contraste espectacular, el núcleo y otras inclusiones intracelulares, así como las bacterias en el medio circundante, pueden localizarse e identificarse fácilmente (Fig. 2D).


Sugerencias de muestra para microscopía de contraste de fase - Biología

La microscopía de contraste de fase, descrita por primera vez en 1934 por el físico holandés Frits Zernike, es una técnica óptica que mejora el contraste que se puede utilizar para producir imágenes de alto contraste de muestras transparentes, como células vivas (generalmente en cultivo), microorganismos, cortes de tejido fino. , patrones litográficos, fibras, dispersiones de látex, fragmentos de vidrio y partículas subcelulares (incluidos núcleos y otros orgánulos).

Figura 1 - Configuración del microscopio de contraste de fase

En efecto, la técnica de contraste de fase emplea un mecanismo óptico para traducir pequeñas variaciones de fase en los correspondientes cambios de amplitud, que pueden visualizarse como diferencias en el contraste de la imagen. Una de las principales ventajas de la microscopía de contraste de fase es que las células vivas pueden examinarse en su estado natural sin haber sido destruidas, fijadas y teñidas previamente. Como resultado, la dinámica de los procesos biológicos en curso se puede observar y registrar en un alto contraste con una claridad nítida de detalles minuciosos de la muestra.

Presentado en Figura 1 es un diagrama recortado de un microscopio de contraste de fase vertical moderno, que incluye una ilustración esquemática del tren óptico de contraste de fase. La iluminación parcialmente coherente producida por la lámpara halógena de tungsteno se dirige a través de una lente colectora y se enfoca en un anillo especializado (etiquetado anillo del condensador) colocado en el plano focal frontal del condensador de la subestación. Los frentes de onda que atraviesan el anillo iluminan la muestra y pasan sin desviarse o son difractados y retardados en fase por las estructuras y gradientes de fase presentes en la muestra. La luz no desviada y difractada recogida por el objetivo se segrega en el plano focal posterior por un placa de fase y enfocado en el plano de imagen intermedio para formar la imagen de contraste de fase final observada en los oculares.

Antes de la invención de las técnicas de contraste de fase, la iluminación de campo claro transmitida era uno de los modos de observación más comúnmente utilizados en microscopía óptica, especialmente para muestras fijas teñidas u otros tipos de muestras que tienen una alta absorción natural de luz visible. En conjunto, las muestras fácilmente fotografiadas con iluminación de campo claro se denominan objetos de amplitud (o muestras) porque la amplitud o intensidad de los frentes de onda iluminadores se reduce cuando la luz pasa a través de la muestra.

La adición de accesorios ópticos de contraste de fase a un microscopio de campo claro estándar se puede emplear como una técnica para generar un efecto de mejora del contraste en muestras transparentes que recuerda a la tinción óptica (ver Figura 2). Ondas de luz que son difractadas y cambiadas de fase por la muestra (denominadas objeto de fase) se puede transformar mediante contraste de fase en diferencias de amplitud que se pueden observar en los oculares. Las muestras grandes y extendidas también se visualizan fácilmente con óptica de contraste de fase debido a los fenómenos de difracción y dispersión que ocurren en los bordes de estos objetos. El rendimiento de los microscopios de contraste de fase modernos es tan refinado que permite detectar muestras que contienen estructuras internas muy pequeñas, o incluso unas pocas moléculas de proteína, cuando la tecnología se combina con la mejora electrónica y el procesamiento de imágenes posterior a la adquisición.

Presentado en Figura 2 es una comparación de células vivas en cultivo fotografiadas tanto en campo claro como en iluminación de contraste de fase. Las células son tejido cerebral de la glía humana crecido en cultivo monocapa bañado con un medio nutritivo que contiene aminoácidos, vitaminas, sales minerales y suero de ternero fetal. En iluminación de campo claro (Figura 2 (a)), las células aparecen semitransparentes y solo se ven regiones altamente refractivas, como la membrana, el núcleo y las células sueltas (redondeadas o esféricas). Cuando se observa usando accesorios ópticos de contraste de fase, el mismo campo de visión revela significativamente más detalles estructurales (Figura 2 (b)). Los apegos celulares se vuelven perceptibles, al igual que gran parte de la estructura interna. Además, el rango de contraste se mejora drásticamente.

Figura 2 - Células vivas en campo claro y contraste de fase

El desarrollo de Zernike de la teoría óptica de contraste de fase es un excelente ejemplo de cómo los resultados de la investigación de un campo altamente especializado (en este caso, la física teórica) pueden producir nuevos desarrollos innovadores en disciplinas aparentemente no relacionadas, como la biología y la medicina. Durante la Segunda Guerra Mundial, Zeiss Optical Works en Jena, Alemania, fue el primer fabricante en incorporar ópticas prácticas de contraste de fase en sus microscopios. El impacto inmediato en la investigación biológica fue significativo y la aplicación generalizada de la técnica continúa hasta el día de hoy. Los objetivos de contraste de fase modernos, diseñados y producidos por Nikon y otros fabricantes ópticos, pueden funcionar en combinación con técnicas auxiliares de mejora del contraste, como contraste de interferencia diferencial, fluorescencia y luz polarizada. Estos objetivos están disponibles con placas de fase interna que tienen diferentes niveles de absorción y desplazamiento de fase de la iluminación envolvente (no difractada) para producir un amplio espectro de opciones de contraste de muestra e intensidad de fondo para microscopía de contraste de fase.

Interacción de ondas de luz con muestras de fase

Un frente de onda incidente presente en un haz de luz iluminante se divide en dos componentes al pasar a través de una muestra de fase. El componente principal es un no desviado (o no difractado orden cero) frente de onda planar, comúnmente conocido como el rodear (S) onda, que atraviesa y rodea la muestra, pero no interactúa con ella. Además, una desviación o difractado frente de onda esféricoD-onda), que se dispersa en un amplio arco (en muchas direcciones) que atraviesa la apertura total del objetivo. Después de abandonar el plano de la muestra, las ondas de luz envolventes y difractadas entran en el elemento de la lente frontal del objetivo y posteriormente se enfocan en el plano de imagen intermedio donde se combinan a través de la interferencia para producir una resultante. partícula ola (a menudo denominada PAG-ola). La relación matemática entre las diversas ondas de luz generadas en la microscopía de contraste de fase se puede describir simplemente como:

Fórmula 1 - Relación entre varias ondas de luz generadas en microscopía de contraste de fase

La detección de la imagen de la muestra depende de las diferencias de intensidad relativa y, por lo tanto, de las amplitudes de la partícula y el entorno (PAG y S) ondas. Si las amplitudes de la partícula y las ondas circundantes son significativamente diferentes en el plano de imagen intermedio, entonces la muestra adquiere una cantidad considerable de contraste y se visualiza fácilmente en los oculares del microscopio. De lo contrario, la muestra permanece transparente y aparece como lo haría en condiciones normales de campo claro (en ausencia de contraste de fase u otras técnicas de mejora del contraste).

En términos de variaciones de la trayectoria óptica entre la muestra y su medio circundante, la porción del frente de onda de luz incidente que atraviesa la muestra (D-wave), pero no atraviesa el medio circundante (S-wave), se retrasa ligeramente. Para los argumentos en microscopía de contraste de fase, el papel de la muestra en la alteración de la longitud de la trayectoria óptica (en efecto, el desplazamiento de fase relativo) de las ondas que la atraviesan es de suma importancia. En óptica clásica, la longitud del camino óptico (OPL) a través de un objeto o espacio es el producto del índice de refracción (norte) y el espesor (t) del objeto o medio interviniente según lo descrito por la relación:

Fórmula 2 - Longitud de la ruta óptica

Longitud de la ruta óptica (OPL) = n × t

Cuando la luz pasa de un medio a otro, la velocidad se altera proporcionalmente a las diferencias del índice de refracción entre los dos medios. Por lo tanto, cuando una onda de luz coherente emitida por el filamento del microscopio enfocado pasa a través de una muestra de fase que tiene un espesor específico (t) e índice de refracción (norte), la velocidad de la onda aumenta o disminuye. Si el índice de refracción de la muestra es mayor que el del medio circundante, la onda se reduce en velocidad mientras pasa a través de la muestra y posteriormente se retarda en fase relativa cuando emerge de la muestra. Por el contrario, cuando el índice de refracción del medio circundante excede al de la muestra, la onda avanza en fase al salir de la muestra. La diferencia en la ubicación de un frente de onda emergente entre la muestra y el medio circundante se denomina cambio de fase (δ) y se define en radianes como:

Fórmula 3 - Cambio de fase

En la ecuación anterior, el término D se conoce como el diferencia de trayectoria óptica, que es similar a la longitud del camino óptico:

Fórmula 4 - Diferencia de ruta óptica

Diferencia de trayectoria óptica (OPD) = Δ = (n2 - n1) × t

dónde n (2) es el índice de refracción de la muestra y n (1) es el índice de refracción del medio circundante. La diferencia de trayectoria óptica resulta del producto de dos términos: el grosor de la muestra y su diferencia en el índice de refracción con el medio circundante. En muchos casos, la diferencia de trayectoria óptica puede ser bastante grande aunque el grosor de la muestra sea pequeño. Por otro lado, cuando el índice de refracción de la muestra es igual al del medio circundante, la diferencia de trayectoria óptica es cero independientemente de si el espesor de la muestra es grande o pequeño.

Tutorial interactivo - Variaciones de la longitud de la trayectoria óptica de la muestra

Explore los efectos de los cambios en el índice de refracción y el grosor en la longitud de la trayectoria óptica y descubra cómo dos muestras pueden tener diferentes combinaciones de estas variables pero seguir mostrando la misma longitud de trayectoria.

Para células individuales en cultivo de tejidos, la diferencia de trayectoria óptica es relativamente pequeña. Una célula típica en cultivo en monocapa tiene un grosor de alrededor de 5 micrómetros y un índice de refracción de aproximadamente 1,36. La célula está rodeada por un medio nutritivo que tiene un índice de refracción de 1,335, lo que produce una diferencia de trayectoria óptica de 0,125 micrómetros, o aproximadamente un cuarto de longitud de onda (de luz verde). Las estructuras subcelulares generan retrasos mucho menores. Estas pequeñas diferencias en la trayectoria óptica producen una reducción lineal en la intensidad con el aumento del cambio de fase (la imagen se oscurece progresivamente) hasta un punto (dependiendo de la configuración de la placa de fase), después de lo cual, la imagen de la muestra se vuelve más brillante a través de la inversión del contraste. En la microscopía de contraste de fase, la intensidad de una imagen no tiene una relación lineal simple con la diferencia de trayectoria óptica producida por la muestra para todo el rango de espesor e índice de refracción. En cambio, la intensidad depende de una variedad de factores que incluyen la absorción en la placa de fase, el grado de avance o retraso de fase en la placa de fase y el signo relativo de este cambio de fase.

Interacciones de ondas en microscopía de contraste de fase

Relaciones de fase entre el entorno, la difracción y la partícula (S, D, y PAG) Las ondas en la región de la muestra en el plano de la imagen para microscopía de campo claro (en ausencia de accesorios ópticos de contraste de fase) se presentan en figura 3. Las ondas envolventes y de partículas, cuyas amplitudes relativas determinan la cantidad de contraste de la muestra, se ilustran como líneas rojas y verdes (respectivamente). La onda producida por difracción de la muestra, que nunca se observa directamente, se representa como una onda azul de menor amplitud. Las ondas envolventes y difractadas se recombinan a través de la interferencia para generar la onda de partículas resultante en el plano de la imagen del microscopio. La amplitud de cada onda ilustrada en figura 3 representa la suma de los vectores eléctricos de las ondas componentes individuales.

Figura 3 - Relaciones de fase de onda de microscopía de campo claro

En relación con la onda envolvente, la onda difractada tiene menor amplitud (porque hay menos fotones difractados que envolventes en el punto de la imagen) y está retardada en fase aproximadamente 90 grados (un cuarto de longitud de onda) a través de la interacción con la muestra. El ligero cambio de fase de 1/20 de longitud de onda exhibido por la onda de partículas resultante (que surge de la interferencia entre las ondas difractadas y envolventes) se observa típicamente en detalles diminutos en una celda y está relacionado con la diferencia de longitud de la trayectoria óptica. Debido a que las amplitudes de las ondas envolventes y de partículas son casi las mismas, la muestra transparente carece por completo de contraste y es casi invisible cuando se superpone contra el fondo brillante.

La relación entre los frentes de onda individuales en campo claro y microscopía de contraste de fase se puede describir vectorialmente utilizando un sistema de coordenadas polares. En este sistema, la longitud del vector representa la amplitud de una onda particular, mientras que el ángulo de rotación del vector con respecto a una referencia fija (el desplazamiento de fase angular) significa el grado de desplazamiento de fase (ver Figura 3 (b)). La representación vectorial de las interacciones de ondas en la microscopía de contraste de fase fue introducida por Frits Zernike y más tarde desarrollada en detalle por Robert Barer. Aunque esta ayuda descriptiva rara vez se utiliza hoy en día, muchos textos e informes de investigación publicados en los últimos años se basan en discusiones sobre las relaciones de ondas ilustradas por diagramas vectoriales.

En los diagramas vectoriales de contraste de fase, los retardos de fase se ilustran como rotaciones en sentido horario (con referencia a un acimut arbitrario), mientras que los avances de fase se representan como rotaciones en sentido antihorario. En Figura 3 (b), que técnicamente es un diagrama fasorial, la suma vectorial del entorno (S) y difractado (D) frentes de onda produce la partícula resultante (PAG) frente de onda. Este mecanismo de presentar relaciones de ondas es conveniente porque ayuda a visualizar los cambios de fase en la onda difractada y cómo afectan la fase de la onda de partículas resultante (y viceversa). El cambio de fase de la onda difractada en relación con la onda envolvente en el gráfico en Figura 3 (b) se presenta como Φ, donde:

Fórmula 5 - Cambio de fase de la onda difractada en relación con la onda envolvente

En la ecuación, φ es el desplazamiento de fase relativo (una función de la diferencia de trayectoria óptica) entre el entorno (S) y partícula (PAG) vectores de onda. Para muestras que muestran una diferencia de trayectoria óptica insignificante (en efecto, sin desplazamiento de fase), el último término de la ecuación es igual a cero y Φ se convierte en ± 90 grados. Como se presenta en Figura 3 (b), un difractado (D) La onda que tiene una amplitud muy baja y un cambio de fase pequeño (o inexistente) da como resultado una onda de partículas con una amplitud que es casi igual a la de la onda envolvente. Cuando las ondas envolventes y de partículas tienen amplitudes (o intensidades) similares, no se genera contraste y la muestra permanece invisible sobre un fondo brillante.

El microscopio de contraste de fase

El concepto más importante que subyace al diseño de un microscopio de contraste de fase es la segregación de los frentes de onda envolventes y difractados que emergen de la muestra, que se proyectan en diferentes ubicaciones en el plano focal posterior del objetivo (el difracción plano en la apertura trasera del objetivo). Además, la amplitud de la luz envolvente (no desviada) debe reducirse y la fase debe adelantarse o retrasarse (en un cuarto de longitud de onda) para maximizar las diferencias de intensidad entre la muestra y el fondo en el plano de la imagen. El mecanismo para generar un retardo de fase relativo es un proceso de dos pasos, en el que las ondas difractadas se retardan en fase un cuarto de longitud de onda en la muestra, mientras que las ondas envolventes avanzan (o retardan) en fase mediante una placa de fase colocada en o muy cerca del plano focal posterior del objetivo. Solo se requieren dos accesorios especializados para convertir un microscopio de campo claro para la observación de contraste de fase. En el plano focal frontal del condensador se coloca un diafragma anular especialmente diseñado, que se combina en diámetro y se conjuga ópticamente con una placa de fase interna que reside en el plano focal posterior del objetivo.

Figura 4 - Tren óptico de microscopio de contraste de fase

los anillo del condensador (ilustrado en Figura 1 y Figura 4) se construye típicamente como una placa opaca de color negro plano (absorbente de luz) con un anillo anular transparente, que se coloca en el plano focal frontal (apertura) del condensador para que la muestra pueda ser iluminada por frentes de onda de luz paralelos y desenfocados que emanan del anillo. El condensador del microscopio genera una imagen del diafragma anular en el infinito, mientras que el objetivo produce una imagen en el plano focal posterior (donde se coloca una placa de fase conjugada, como se explica a continuación). Cabe señalar que muchos textos describen la iluminación que emerge del condensador de un microscopio de contraste de fase como un cono hueco de luz con un centro oscuro. Este concepto es útil para describir la configuración, pero no es estrictamente preciso. El anillo del condensador reemplaza o reside cerca del diafragma de iris ajustable en la apertura frontal del condensador. Al realizar experimentos de contraste de fase utilizando un condensador con un anillo de fase y un diafragma de apertura, verifique que el diafragma de iris se abra más que la periferia del anillo de fase. A diferencia del contraste de interferencia diferencial y el contraste de modulación de Hoffman, la geometría circular de la iluminación y detección de contraste de fase permite la observación de la muestra sin artefactos dependientes de la orientación. El contraste de fase también es insensible a los efectos de polarización y birrefringencia, lo cual es una gran ventaja cuando se examinan células vivas que crecen en recipientes de cultivo de tejidos de plástico.

En condiciones de iluminación de Köhler, las ondas de luz envolventes que no interactúan con la muestra se enfocan como un anillo brillante en el plano focal posterior del objetivo (el plano de difracción). En estas condiciones, el plano focal posterior del objetivo se conjuga con el plano de apertura frontal del condensador, por lo que las ondas de luz no difractadas (orden cero) forman una imagen brillante del anillo del condensador en la apertura posterior del objetivo (superpuesta sobre la imagen del placa de fase). El frente de onda esférico difractado por la muestra (el D ondas) pasa a través del plano de difracción en varios lugares a través de toda la apertura trasera del objetivo. La distribución (cantidad y ubicación) de la luz difractada depende del número, tamaño y diferencial del índice de refracción de los objetos que dispersan la luz en la muestra. Para la mayoría de las muestras, solo se difracta una pequeña parte de las ondas de luz incidentes y la mayoría de la luz pasa sin desviarse para iluminar finalmente todo el plano de la imagen.

Por el contrario, el frente de onda plano envolvente ocupa una proporción más pequeña de la apertura posterior del objetivo, que corresponde al conjugado del anillo del condensador. Por lo tanto, los dos frentes de onda no se superponen de manera significativa y ocupan porciones distintas del plano focal posterior del objetivo. Debido a que la luz directa de orden cero y la luz difractada están separadas espacialmente en el plano de difracción, la fase de cualquier componente de onda (envolvente, S o difractado, D) se puede manipular selectivamente sin interferir con el otro.

Tutorial interactivo - Vías ópticas en el microscopio de contraste de fase

Examine las vías de luz a través de un microscopio de contraste de fase y aprenda cómo estos sistemas diseccionan la onda electromagnética incidente en un componente envolvente (S), difractado (D) y de partícula resultante (P).

A placa de fase está montado en o cerca del plano focal posterior del objetivo (ver Figuras 4 y 5) para alterar selectivamente la fase y amplitud de la luz envolvente (o no desviada) que atraviesa la muestra. En algunos objetivos de contraste de fase, la placa de fase delgada contiene un anillo grabado en el vidrio que tiene un espesor reducido para avanzar diferencialmente la fase del marco (S) onda por un cuarto de longitud de onda. A menudo, el anillo también se recubre con una película metálica parcialmente absorbente para reducir la amplitud de la luz envolvente en un 60-90 por ciento. Debido a que el plano focal posterior generalmente reside cerca de un elemento de lente interno, algunos objetivos de contraste de fase se producen al grabar realmente en la superficie de una lente. Independientemente de cómo se fabrique el objetivo, el punto más importante a recordar es que cada objetivo de contraste de fase se modifica para incluir la placa de fase, una característica que está ausente en todos los demás objetivos del microscopio.

Debido a que la onda de partículas resultante se produce exclusivamente por la interferencia del entorno y los frentes de onda difractados, la interferencia entre los frentes de onda que llegan al plano de la imagen genera una partícula (PAG) onda que tiene una amplitud que ahora es considerablemente menor que la del entorno cuando se aplica el recubrimiento de densidad neutra. El efecto neto es transformar la diferencia de fase relativa introducida por la muestra en una diferencia de amplitud (intensidad) de la luz que emerge del plano de la imagen. Debido a que el ojo humano interpreta las diferencias de intensidad como contraste, la muestra ahora es visible en los oculares del microscopio y también se puede capturar en una película con un sistema de cámara tradicional, o digitalmente, utilizando un dispositivo CCD o CMOS. Todos positivo Los sistemas de contraste de fase avanzan selectivamente la fase del sonido envolvente lineal (S) frente de onda relativo al del esférico difractado (D) frente de onda. Alternativamente, negativo El contraste de fase retarda el frente de onda envolvente con respecto a las ondas de luz difractadas por la muestra.

En general, los especímenes que tienen un índice de refracción más alto que el medio circundante aparecen oscuros sobre un fondo gris neutro, mientras que los especímenes que tienen un índice de refracción más bajo que el medio de baño aparecen más brillantes que el fondo gris. Sin embargo, este no es siempre el caso, porque los objetivos de contraste de fase especializados que tienen densidades neutrales más altas acopladas a valores de retardo más bajos (un octavo de longitud de onda o menos) pueden producir inversión de contraste en muestras más gruesas. El resultado neto es que las regiones con diferencias de trayectoria óptica muy altas comienzan a aparecer brillantes.

Para modificar la fase y amplitud de los frentes de onda difractados y envolventes espacialmente separados en sistemas ópticos de contraste de fase, se han introducido varias configuraciones de placa de fase. Debido a que la placa de fase se coloca en o muy cerca del plano focal posterior del objetivo (el plano de difracción), toda la luz que pasa a través del microscopio debe viajar a través de este componente. La parte de la placa de fase sobre la que se enfoca el anillo del condensador se denomina área conjugada, mientras que las regiones restantes se denominan colectivamente zona complementaria. El área conjugada contiene el material responsable de alterar la fase de la luz envolvente (no difractada) en más o menos 90 grados con respecto a la de los frentes de onda difractados. En general, el área conjugada de la placa de fase es más ancha (en aproximadamente un 25 por ciento) que la región definida por la imagen del anillo del condensador para minimizar la cantidad de luz envolvente que se propaga hacia el área complementaria.

Figura 5 - Aperturas objetivas y óptica de contraste de fase

En Figura 5. Como regla general, cuando se aumenta la apertura numérica del objetivo y el aumento, el ancho y el diámetro de la placa de fase disminuyen. Por el contrario, el tamaño del anillo del condensador aumenta con el aumento del objetivo. También ilustrado en Figura 5 son diagramas de corte que muestran los conceptos básicos detrás de la construcción de placas de fase positiva y negativa. La placa de fase positiva produce un contraste oscuro y contiene una película parcialmente absorbente diseñada para reducir la amplitud del frente de onda envolvente. Además, esta placa contiene material retardador de fase diseñado para cambiar (retardar) la fase de la luz difractada en 90 grados. La placa de fase negativa también contiene materiales retardadores de fase y parcialmente absorbentes. Sin embargo, en este caso, ambos materiales están intercalados dentro de la placa de fase de modo que el frente de onda envolvente no difractado es la única especie afectada (atenuada y retardada en fase en 90 grados).

La mayoría de las placas de fase disponibles de los fabricantes de microscopios modernos se producen mediante deposición al vacío de películas metálicas y dieléctricas delgadas sobre una placa de vidrio o directamente sobre una de las superficies de la lente dentro del objetivo del microscopio. El papel de la película delgada dieléctrica es cambiar la fase de la luz, mientras que la película metálica atenúa la intensidad de la luz no difractada. Algunos fabricantes utilizan múltiples recubrimientos antirreflejos en combinación con las películas delgadas para reducir la cantidad de deslumbramiento y luz parásita reflejada en el sistema óptico. Si la placa de fase no se forma en la superficie de una lente, generalmente se cementa entre lentes sucesivas que residen cerca del plano focal posterior del objetivo. El espesor y los índices de refracción de las películas dieléctricas, metálicas y antirreflectantes, así como los del cemento óptico, se seleccionan cuidadosamente para producir el desplazamiento de fase necesario entre las áreas complementarias y conjugadas de la placa de fase. En terminología óptica, las placas de fase que alteran la fase de la luz envolvente en relación con la luz difractada en 90 grados (positiva o negativa) se denominan cuarto de longitud de onda placas debido a su efecto sobre la diferencia de trayectoria óptica.

El contraste se modula variando las propiedades de la placa de fase, incluida la absorción de la película metálica (o revestimientos antirreflectantes), el índice de refracción del material retardador de fase y el grosor de la placa de fase. Varios fabricantes de microscopios ofrecen una variedad de objetivos de contraste de fase que tienen grados progresivos de contraste. Por ejemplo, la línea Nikon incluye cinco tipos de objetivos de contraste de fase. los DL (Oscuro Bajo) serie de objetivos produce un contorno de imagen oscuro sobre un fondo gris claro. Estos objetivos están diseñados para proporcionar un contraste positivo en muestras que tienen una diferencia significativa en el índice de refracción del medio circundante, como las células de cultivo de tejidos. Un objetivo de la versión de contraste ligeramente más bajo, el DLL (Oscuro Bajo Bajo), produce mejores imágenes en iluminación de campo claro que los objetivos DL y se utiliza como un objetivo universal para observaciones combinadas en fluorescencia, campo claro, campo oscuro y contraste de interferencia diferencial.

Nikon también produce apodizado Objetivos de contraste de fase que contienen un anillo secundario de densidad neutra, diseñado para reducir los artefactos de halo, a cada lado del anillo de fase central. Las muestras que tienen diferencias de fase muy pequeñas son candidatas ideales para la obtención de imágenes con Nikon. DM (Medio oscuro) objetivos de contraste de fase positivo, que producen un contorno de imagen oscuro sobre un fondo gris medio. Para el contraste de fase negativo, Nikon ofrece la BM (Medio brillante) objetivo, que es especialmente adecuado para el examen visual de flagelos bacterianos, protozoos, fibras de fibrina, glóbulos diminutos y células sanguíneas. Los objetivos de contraste de fase medio brillante producen imágenes brillantes sobre un fondo gris medio. Nikon ofrece además un módulo de contraste de fase externo para ciertos modelos de microscopio invertido que permite a los usuarios realizar imágenes de contraste de fase con objetivos de alto rendimiento sin contraste de fase. Este módulo permite la inserción de un anillo de fase en un plano conjugado con la apertura trasera del objetivo.

En la mayoría de los casos, el simple avance de la fase relativa del frente de onda envolvente por sí solo es insuficiente para generar imágenes de alto contraste en el microscopio. Esto ocurre porque la amplitud de las ondas envolventes es significativamente mayor que la de las ondas difractadas y suprime las imágenes resultantes creadas por la interferencia de solo una pequeña parte del número total de ondas. Para reducir la amplitud del frente de onda envolvente a un valor más cercano al de la onda difractada (y hacer cumplir la interferencia en el plano de la imagen), la placa de fase en el objetivo aumenta en opacidad mediante la aplicación de un metal semitransparente (neutral densidad) revestimiento. Las ondas de luz circundantes, que pasan casi exclusivamente a través de la placa de fase por diseño en el microscopio de contraste de fase, se reducen drásticamente en amplitud por la placa de fase opaca a un valor que oscila entre el 10 y el 30 por ciento de la intensidad original.

Las configuraciones de la placa de fase, las relaciones de onda y los diagramas vectoriales asociados con la generación de imágenes de contraste de fase positivo y negativo se presentan en Figura 6. Además, también se ilustran ejemplos de muestras obtenidas mediante estas técnicas. Como se discutió anteriormente, el frente de onda esférico de la luz difractada que emerge del plano de la muestra se retarda un cuarto de longitud de onda con respecto a la fase del frente de onda envolvente plano (o no difractado). En la configuración óptica de contraste de fase positivo (fila superior de imágenes en Figura 6), el entorno (S) el frente de onda avanza en fase un cuarto de longitud de onda al atravesar la placa de fase para producir un cambio de fase neto de 180 grados (media longitud de onda). El frente de onda envolvente avanzado ahora puede participar en una interferencia destructiva con el difractado (D) ondas en el plano de imagen intermedio.

Figura 6 - Sistemas de contraste de fase positivo y negativo

En la parte superior de la página se presenta una descripción general del contraste de fase positivo. Figura 6. Placas de contraste de fase positiva (lado izquierdo de Figura 6) hacen avanzar la onda envolvente en un cuarto de longitud de onda debido al anillo grabado en la placa de vidrio que reduce el camino físico tomado por las ondas a través de la placa de alto índice de refracción. Debido a que los rayos difractados del espécimen (Dondas) se retardan en un cuarto de longitud de onda cuando interactúan con la muestra, la diferencia de trayectoria óptica entre las ondas envolventes y difractadas al emerger de la placa de fase es la mitad de la longitud de onda. El resultado neto es una diferencia de trayectoria óptica de 180 grados entre las ondas envolventes y difractadas, lo que da como resultado una interferencia destructiva para una muestra de alto índice de refracción en el plano de la imagen. Los perfiles de amplitud de las ondas de interferencia destructiva para el contraste de fase positivo se muestran en el gráfico superior de Figura 6. La amplitud de la partícula resultante (PAG) la onda es más baja que la envolvente (S) onda, haciendo que el objeto parezca relativamente más oscuro que el fondo, como lo ilustra la imagen de Zygnema algas verdes en el extremo derecho (etiquetadas POS). Un diagrama vectorial que ilustra el avance de la onda envolvente en un cuarto de longitud de onda, que se muestra como una rotación de 90 grados en sentido antihorario en contraste de fase positivo, aparece entre el gráfico y la imagen en Figura 6.

También es posible producir sistemas ópticos de microscopio que produzcan un contraste de fase negativo, como se ilustra en la parte inferior de Figura 6. En este caso, el sonido envolvente (S) la onda se retarda (en lugar de avanzar) en un cuarto de longitud de onda en relación con la difractada (D) ola. El resultado es que las muestras que tienen índices de refracción altos aparecen brillantes contra un fondo gris más oscuro (vea la imagen etiquetada NEG en la parte inferior de Figura 6). En contraste de fase negativo, la placa de fase objetiva contiene un anillo elevado que retarda la fase (en lugar de avanzar la fase como en el contraste de fase positivo) de la onda envolvente de orden cero en un cuarto de longitud de onda en relación con la fase de la onda difractada. Debido a que la onda difractada ya ha sido retardada en un cuarto de longitud de onda al pasar a través de la muestra, se elimina la diferencia de trayectoria óptica entre las ondas envolvente y difractada, y se produce interferencia constructiva para una muestra de alto índice de refracción en el plano de la imagen. Tenga en cuenta que la partícula resultante (PAG) la onda es más alta en amplitud que la envolvente (S) onda en contraste de fase negativo (ver el gráfico inferior en Figura 6). También se ilustra el diagrama vectorial para el contraste de fase negativo, donde el vector de onda envolvente experimenta una rotación de 90 grados en el sentido de las agujas del reloj.

Tutorial interactivo - Contraste de fase positiva y negativa

Este tutorial interactivo explora las relaciones entre las ondas envolventes (S), difractadas (D) y de partículas resultantes (P) en campo claro, así como microscopía de contraste de fase positiva y negativa.

Es importante señalar que el patrón de difracción formado en el plano focal posterior del objetivo es la transformada de Fourier de todas las frecuencias espaciales desviadas y dispersas por la muestra en contraste de fase y todas las demás formas de microscopía óptica. En consecuencia, la imagen producida en el plano de imagen intermedio y la imagen final observada a través de los oculares (o registrada por un detector) representan transformadas de Fourier inversas de los patrones de difracción formados en el plano focal posterior del objetivo y el punto del ojo (flotando sobre la lente frontal del ocular). ), respectivamente. La microscopía de contraste de fase aprovecha estas propiedades ópticas conjugadas para mejorar el contraste de la imagen modificando la función de apertura del microscopio para introducir filtración espacial de información de imagen específica. La introducción de una placa de fase (filtro) en el plano de difracción posterior del objetivo permite la transformación de las variaciones de fase de la muestra en variaciones de intensidad que se pueden observar en la imagen final.

Interpretación de imágenes de contraste de fase

Las imágenes producidas por microscopía de contraste de fase son relativamente sencillas de interpretar cuando la muestra es delgada y está distribuida uniformemente sobre el sustrato (como es el caso de las células vivas cultivadas en cultivos de tejidos en monocapa). Cuando se examinan muestras delgadas utilizando ópticas de contraste de fase positivo, que es la forma tradicional que producen la mayoría de los fabricantes, aparecen más oscuras que el medio circundante cuando el índice de refracción de la muestra supera al del medio. La óptica de contraste de fase mejora de manera diferencial el contraste cerca de los bordes que rodean las muestras extendidas, como el límite entre una membrana celular y el medio nutritivo de baño, y produce imágenes generales de alto contraste que pueden interpretarse aproximadamente como mapas de densidad. Debido a que la amplitud e intensidad de una imagen de muestra en contraste de fase está relacionada con el índice de refracción y la longitud del camino óptico, la densidad de la imagen se puede utilizar como un indicador para aproximar las relaciones entre varias estructuras. En efecto, una serie de orgánulos celulares internos que tienen una densidad creciente, como las vacuolas, el citoplasma, el núcleo en interfase y el nucleolo (o cromosomas mitóticos), se visualizan típicamente como objetos progresivamente más oscuros en relación con una referencia fija, como el fondo. También debe tenerse en cuenta que existen numerosos artefactos ópticos en todas las imágenes de contraste de fase, y las muestras grandes y extendidas a menudo presentan fluctuaciones significativas en el contraste y la intensidad de la imagen. La simetría también puede ser un factor importante para determinar cómo aparecen tanto las muestras grandes como las pequeñas en el microscopio de contraste de fase.

La interpretación sensata de las imágenes de contraste de fase requiere un escrutinio y examen cuidadosos para garantizar que los artefactos no se asignen incorrectamente a características estructurales importantes. Por ejemplo, algunos orgánulos y componentes celulares internos a menudo tienen un índice de refracción más bajo que el del citoplasma circundante, mientras que otros tienen un índice de refracción más alto. Debido a los índices de refracción variables exhibidos por estas numerosas estructuras intracelulares, el interior de las células vivas, cuando se observa en un microscopio de contraste de fase positivo, puede revelar una variedad de intensidades que van desde muy brillantes a extremadamente oscuras. Por ejemplo, las vesículas pinocitóticas, las gotitas de lípidos y las vacuolas de aire presentes en las plantas y los protozoos unicelulares tienen un índice de refracción más bajo que el citoplasma y, por lo tanto, parecen más brillantes que otros componentes. Por el contrario, como se mencionó anteriormente, los orgánulos que tienen índices de refracción altos (núcleos, ribosomas, mitocondrias y nucleolo) aparecen oscuros en el microscopio. Si el retardo de fase introducido por la muestra es lo suficientemente grande (un cambio de fase de la onda difractada en aproximadamente media longitud de onda), la interferencia entre las ondas difractadas y las ondas envolventes se vuelve constructiva, haciendo que estas muestras sean más brillantes que el fondo circundante.

Para evitar confusiones con respecto al contraste brillante y oscuro en las imágenes de contraste de fase, se deben considerar cuidadosamente las diferencias de trayectoria óptica que ocurren dentro de la preparación de la muestra. Como se discutió anteriormente, la diferencia de trayectoria óptica se deriva del producto del índice de refracción y el espesor de la muestra (objeto), y está relacionada con el cambio de fase relativo entre la muestra y las ondas de fondo (difractadas y envolventes). Es imposible distinguir entre componentes de índice de refracción alto y bajo en una imagen de contraste de fase sin información perteneciente al grosor relativo de los componentes. Por ejemplo, una muestra pequeña que tiene un índice de refracción alto puede mostrar una diferencia de trayectoria óptica idéntica a una muestra más grande que tiene un índice de refracción más bajo. Las dos muestras tendrán aproximadamente la misma intensidad cuando se vean a través de un sistema óptico de contraste de fase. En muchos experimentos biológicos, las condiciones que producen un encogimiento o hinchazón de células u orgánulos pueden resultar en variaciones de contraste significativas. El medio externo también se puede reemplazar por otro que tenga un índice de refracción mayor o menor para generar cambios en el contraste de la imagen de la muestra. De hecho, el efecto sobre el contraste de la imagen de las variaciones del índice de refracción en el medio circundante forma la base de la técnica conocida como refractometría de inmersión.

Figura 7 - Muestras en Contraste de Fase Positivo y Negativo

Presentado en Figura 7 son varias muestras semitransparentes fotografiadas con sistemas ópticos de contraste de fase positivo y negativo. Las Figuras 7 (a) y 7 (b) ilustran una escama de pez ctenoide en contraste de fase positivo (Figura 7 (a)) y contraste de fase negativo (Figura 7 (b)) con un aumento relativamente alto (200x). Estas escamas se encuentran comúnmente en la mayoría de óseo peces (conocidos como los Teleostei). La parte anterior (o frontal) de cada escala generalmente se coloca detrás de la parte posterior de la escala anterior. A medida que el pez crece, también lo hacen las escamas, lo que da como resultado un patrón de "anillos" concéntricos de crecimiento que aumentan en número con el tamaño de la escala y parecen similares a los que se encuentran en la sección transversal de los troncos de los árboles. En algunos casos, se utilizan patrones de crecimiento de escamas ctenoides para estimar la edad de un pez. Los anillos de crecimiento aparecen oscuros rodeados por regiones de halo gris más claro en contraste de fase positivo (Figura 7 (a)), pero se vuelven mucho más claros y están rodeados de valles oscuros con contraste de fase negativo (Figura 7 (b)).

Un cultivo de células de ovario de hámster chino vivo parece transparente en modo de iluminación de campo claro cuando se baña en medio de crecimiento, y las células tienen un índice de refracción que está muy cerca del tampón salino nutritivo. En contraste de fase positivo (Figura 7 (c)), los detalles celulares internos, incluidos el núcleo y los orgánulos, se pueden visualizar fácilmente. Sin embargo, cuando se examinan con iluminación de contraste de fase negativa, los contornos celulares se vuelven difíciles de distinguir y los detalles internos se oscurecen en gran medida con la excepción de los orgánulos de alto índice de refracción que se vuelven muy brillantes (Figura 7 (d)). Finalmente, los eritrocitos humanos aparecen como elipsoides achatados de color gris oscuro con un contorno de rosquilla y centros brillantes en contraste de fase positivo (Figura 7 (e)), pero las mismas células son brillantes con centros oscuros (Figura 7 (f)) y se destacan claramente del fondo en contraste de fase negativo.

Dos efectos muy comunes en las imágenes de contraste de fase son la característica aureola y sombra patrones de contraste en los que la intensidad observada no se corresponde directamente con la diferencia del camino óptico (índice de refracción y valores de espesor) entre la muestra y el medio circundante. Aunque estos patrones se producen como resultado natural del sistema óptico de contraste de fase, a menudo se denominan artefactos de fase o distorsiones de imagen. En todas las formas de contraste de fase positivo, brillante halos de fase generalmente rodean los límites entre las características de los especímenes grandes y el medio. Los halos idénticos parecen más oscuros que la muestra con sistemas ópticos de contraste de fase negativo. Estos efectos se acentúan aún más por las fluctuaciones de diferencia de trayectoria óptica, que pueden hacer que los halos brillantes se vuelvan oscuros en el contraste de fase positivo y los halos oscuros brillantes en el contraste de fase negativo.

Los halos se producen en la microscopía de contraste de fase porque el anillo de retardo de fase circular (y densidad neutra) ubicado en la placa de fase del objetivo también transmite un pequeño grado de luz difractada de la muestra (no se limita a pasar ondas envolventes solamente). El problema se agrava por el hecho de que la anchura del frente de onda envolvente de orden cero proyectado sobre la placa de fase por el anillo del condensador es menor que la anchura real del anillo de la placa de fase. La diferencia de ancho entre el anillo de la placa de fase y el frente de onda envolvente suele ser de alrededor del 25 al 40 por ciento, pero es necesaria debido a las restricciones y requisitos del diseño óptico. Debido a la ubicación espacial del anillo de alteración de fase circular en el plano de difracción objetivo, solo aquellos frentes de onda correspondientes a frecuencias espaciales bajas difractadas por la muestra pasan a través del anillo de la placa de fase. Por lo tanto, las ondas de la muestra difractada que pasan a través de la placa de fase permanecen 90 grados (un cuarto de longitud de onda) fuera de fase con respecto a la luz de orden cero (no desviada o envolvente). El artefacto de halo de contraste de fase resultante se debe a la atenuación de la información de baja frecuencia espacial difractada por la muestra a través de un ángulo muy poco profundo con respecto a los frentes de onda envolventes de orden cero.En efecto, la ausencia de interferencia destructiva entre los frentes de onda de baja frecuencia espacial difractados por el espécimen y las ondas de luz no desviadas produce una inversión de contraste localizada (manifestada por el halo) que rodea al espécimen. Para crear un borde nítido en la imagen, todas las frecuencias espaciales difractadas por la muestra deben estar representadas en la imagen final.

Tutorial interactivo - Artefactos de contraste de fase de sombreado y halo

Explore los artefactos de sombra y halo, donde la intensidad observada no se corresponde directamente con la diferencia de la trayectoria óptica (índice de refracción y valores de espesor) entre la muestra y el medio circundante.

Los halos de contraste de fase son especialmente prominentes y perceptibles alrededor de objetos grandes de baja frecuencia espacial, como núcleos, diatomeas y células enteras. Otro factor que contribuye al artefacto del halo es la redistribución de la energía luminosa en el plano de la imagen, desde las regiones donde es destructiva hacia las regiones donde es constructiva. Los halos grandes y de alto contraste pueden producir imágenes confusas para muestras que generan grandes diferencias en la trayectoria óptica, como eritrocitos, mohos, protozoos, células de levadura y bacterias. Por otro lado, los efectos de halo a menudo pueden enfatizar las diferencias de contraste entre la muestra y el fondo circundante y pueden aumentar la visibilidad de los bordes delgados y los detalles de los bordes en muchas muestras. Este efecto es particularmente útil en el contraste de fase negativo, que produce un halo oscuro que rodea el detalle de la imagen de baja frecuencia. En muchos casos, es posible reducir el grado de cambio de fase y difracción, lo que resulta en una reducción del tamaño del halo alrededor de la muestra. El remedio más fácil para eliminar o atenuar la intensidad de los halos es modificar el índice de refracción del medio de observación con componentes de índice de refracción más alto, como glicerol, manitol, dextrano o albúmina sérica. En algunos casos, cambiar el índice de refracción del medio puede incluso producir una inversión en el contraste de la imagen, volviendo brillantes las características oscuras de la muestra sin alterar significativamente la intensidad del fondo.

El efecto de halo también se puede reducir significativamente utilizando objetivos de fase especialmente diseñados que contienen un pequeño anillo de material de densidad neutra que rodea el material del anillo de fase central cerca de la apertura trasera del objetivo. Estos objetivos se denominan contraste de fase apodizado objetivos y permiten visualizar y fotografiar estructuras de objetos de fase que tienen grandes diferencias de fase con una claridad y una definición de detalle excepcionales. En la mayoría de los casos, las características subcelulares (como los nucléolos) se pueden distinguir claramente por tener un contraste oscuro con los objetivos apodizados, pero estas mismas características tienen halos brillantes o se visualizan como puntos brillantes utilizando ópticas de contraste de fase convencionales. Con la óptica apodizada, el contraste se invierte debido a la gran amplitud de la luz difractada en relación con la de la luz directa que atraviesa la muestra.

En la práctica, la reducción del halo y un aumento en el contraste de la muestra con sistemas ópticos apodizados se pueden lograr mediante la utilización de filtros de amplitud selectivos ubicados adyacentes a la película de fase en las placas de fase integradas en el objetivo en el plano focal posterior. Estos filtros de amplitud consisten en películas delgadas de densidad neutra aplicadas a la placa de fase que rodea la película de fase. La transmitancia del anillo de cambio de fase en la placa de fase clásica es de aproximadamente el 25 por ciento, mientras que el par de anillos adyacentes que rodean el anillo de cambio de fase en la placa apodizada tienen una densidad neutra con una transmitancia del 50 por ciento. El ancho de la película de fase en ambas placas es el mismo. Estos valores son consistentes con los valores de transmitancia de películas delgadas de desplazamiento de fase aplicadas a placas estándar en microscopios de contraste de fase.

Figura 8 - Sombreado en contraste de fase positivo y negativo

El sombreado es otro artefacto óptico muy común en la microscopía de contraste de fase y, a menudo, se observa con mayor facilidad en muestras grandes de fase extendida. Normalmente se esperaría que la imagen de una muestra de fase grande que tiene una longitud de trayectoria óptica constante a lo largo del diámetro parezca uniformemente oscura o clara en el microscopio. Desafortunadamente, la intensidad de las imágenes producidas por un microscopio de contraste de fase no siempre guarda una relación lineal simple con la diferencia de trayectoria óptica producida por la muestra. Otros factores, como la absorción en la placa de fase y la cantidad de retraso o avance de fase, así como el tamaño de solapamiento relativo de la placa de fase y el anillo del condensador también juegan un papel crítico. El perfil de intensidad de una muestra de contraste de fase positiva grande y uniformemente gruesa a menudo aumenta gradualmente desde los bordes hacia el centro, donde la intensidad de la luz en la región central puede acercarse a la del medio circundante (lo contrario es cierto para las muestras de fase negativa). Este efecto se denomina sombreado y se observa con frecuencia al examinar muestras planas extendidas, como placas de material (vidrio o mica), réplicas, células de cultivo de tejidos aplanadas y orgánulos grandes.

Los efectos de los artefactos de halo y sombra en el contraste de fase positivo y negativo se presentan en Figura 8 para una muestra hipotética de fase extendida que tiene geometría rectangular y un índice de refracción más alto que el medio circundante (Figura 8 (a)). El perfil de intensidad registrado en una región central de la muestra se ilustra en Figura 8 (b). En contraste de fase positivo (Figura 8 (c)), la imagen de la muestra exhibe un halo distintivamente brillante y demuestra un efecto de sombra dramático, que se manifiesta por un aumento progresivo de la intensidad al atravesar desde los bordes hasta la región central de la muestra (ver el perfil de intensidad en Figura 8 (d)). Los efectos de halo y sombra han invertido intensidades en el contraste de fase negativo (Figura 8 (e) y 8 (f)). Un halo oscuro rodea la imagen de la muestra cuando se ve con óptica de contraste de fase negativo (Figura 8 (e)), y la transición de sombreado varía de brillante en los bordes a niveles de gris más oscuros en el centro. Además, el perfil de intensidad (Figura 8 (f)) se invierte de la observada con contraste de fase positivo.

El fenómeno de sombra también se denomina comúnmente efecto de zona de acción, porque las zonas centrales que tienen un espesor uniforme en la muestra difractan la luz de manera diferente que las zonas altamente refractivas en los bordes y límites. En las regiones centrales de una muestra, tanto los ángulos relativos como la cantidad de luz difractada se reducen drásticamente en comparación con los bordes. Debido a que los frentes de onda difractados que se originan en las áreas centrales del espécimen tienen solo una desviación espacial marginal de los frentes de onda circundantes no desviados de orden cero (pero aún están retardados en fase por un cuarto de longitud de onda), son capturados por la placa de fase en la parte posterior del objetivo. plano focal, junto con la luz envolvente. Como resultado, la intensidad de la región central de la muestra permanece esencialmente idéntica a la del fondo. La aparición de efectos de sombreado en áreas de muestras planas relativamente planas, junto con el contraste excesivamente alto producido por los bordes y los límites, proporciona una fuerte evidencia de que el mecanismo de contraste de fase está controlado principalmente por los fenómenos combinados de difracción y dispersión.

Los artefactos de halo y sombra dependen de las propiedades geométricas y ópticas de la placa de fase y de la muestra que se examina. En particular, el ancho y la transmitancia del material de la placa de fase juegan un papel crítico en el control de estos efectos (el ancho de la placa de fase es típicamente aproximadamente una décima parte del área de apertura total del objetivo). Las placas de fase más ancha que tienen una transmitancia reducida tienden a producir halos y sombras de mayor intensidad, mientras que el diámetro del anillo tiene una menor influencia sobre estos efectos. Para un objetivo de fase particular (ya sea positivo o negativo), la diferencia de la trayectoria óptica y el tamaño, la forma y la estructura de la muestra tienen una influencia significativa en la gravedad de los efectos de halo y sombreado. Además, estos efectos están fuertemente influenciados por la ampliación del objetivo, con menores aumentos que producen mejores imágenes.

Conclusiones

El contraste de fase es un método excelente para mejorar el contraste de muestras delgadas y transparentes sin pérdida de resolución, y ha demostrado ser una herramienta valiosa en el estudio de eventos dinámicos en células vivas. Antes de la introducción de los sistemas ópticos de contraste de fase, las células y otras muestras semitransparentes se hicieron visibles en microscopía de campo claro mediante técnicas de tinción artificial. Aunque estas muestras se pueden observar y registrar con iluminación de campo oscuro y oblicua, o desenfocando un microscopio de campo claro, esta metodología ha demostrado ser poco confiable para proporcionar información crítica sobre la estructura y función celular.

La técnica del contraste de fases se aplica ampliamente en la investigación biológica y médica, especialmente en los campos de la citología y la histología. Como tal, la metodología se utiliza para examinar células, tejidos y microorganismos vivos que son transparentes bajo iluminación de campo claro. El contraste de fase permite que los componentes celulares internos, como la membrana, los núcleos, las mitocondrias, los husos, el aparato mitótico, los cromosomas, el aparato de Golgi y los gránulos citoplasmáticos de las células y tejidos vegetales y animales, se visualicen fácilmente. Además, la microscopía de contraste de fase se emplea ampliamente en el diagnóstico de células tumorales y el crecimiento, la dinámica y el comportamiento de una amplia variedad de células vivas en cultivo. Se han desarrollado sistemas ópticos especializados de contraste de fase de larga distancia de trabajo para microscopios invertidos empleados para investigaciones de cultivo de tejidos. Otras áreas en el campo biológico que se benefician de la observación de contraste de fase son la hematología, virología, bacteriología, parasitología, paleontología y biología marina.

Las aplicaciones industriales y químicas para el contraste de fases incluyen investigaciones de mineralogía, cristalografía y morfología de polímeros. Los microcristales, polvos, partículas sólidas y polímeros cristalinos incoloros, que tienen un índice de refracción que difiere solo ligeramente del del líquido de inmersión circundante, a menudo se observan fácilmente usando microscopía de contraste de fase. De hecho, la refractometría cuantitativa se utiliza a menudo para obtener valores de índice de refracción y con fines de identificación. Otros productos comerciales examinados mediante técnicas ópticas de contraste de fase incluyen arcillas, grasas, aceites, jabones, pinturas, pigmentos, alimentos, medicamentos, textiles y otras fibras.

La microscopía de contraste de fase de luz incidente, aunque reemplazada en gran medida por técnicas de contraste de interferencia diferencial, es útil para el examen de superficies, incluidos circuitos integrados, dislocaciones de cristales, defectos y litografía. Un buen ejemplo son las fallas de apilamiento en las obleas epitaxiales de silicio, que son de enorme importancia para la industria de los semiconductores. En los sistemas de contraste de fase de luz reflejada, se proyecta una imagen del anillo de iluminación en el plano focal posterior del objetivo, donde normalmente se encuentra la placa de fase. Además, la placa de fase no se coloca dentro del objetivo, sino que se forma una imagen del plano focal posterior mediante un sistema de lentes auxiliares que evita los reflejos y la dispersión generados por la placa de fase. Cabe señalar que en la microscopía de contraste de fase de luz reflejada, las diferencias de fase surgen del relieve en las superficies de la muestra, en lugar de los gradientes de fase dentro de la muestra.

La reducción del halo y los artefactos de sombreado sigue siendo una preocupación principal en la microscopía de contraste de fase. Las placas de fase apodizada son útiles para reducir la gravedad del halo, y los sistemas especializados de contraste de fase variable se pueden ajustar para controlar estos efectos con el fin de optimizar la calidad de la imagen y la fidelidad de la información obtenida mediante la técnica. También existe un interés considerable en el desarrollo de sistemas avanzados de contraste de fase que proporcionen mediciones precisas de muestras de fase que tienen grandes diferencias de trayectoria óptica, así como observaciones combinadas con otras técnicas de mejora del contraste. En particular, el contraste de fase se utiliza a menudo con imágenes de fluorescencia para determinar la ubicación de los fluoróforos y parece prometedor para mejorar el contraste en la microscopía óptica de barrido.

Autores colaboradores

Douglas B. Murphy - Departamento de Biología Celular y Anatomía y Microscopio, Facultad de Medicina de la Universidad Johns Hopkins, 725 N. Wolfe Street, 107 WBSB, Baltimore, Maryland 21205.

Ron Oldfield - Departamento de Ciencias Biológicas, División de Ciencias Ambientales y de la Vida, Universidad Macquarie, Nueva Gales del Sur 2109, Australia.

Stanley Schwartz - Departamento de Biociencia, Nikon Instruments, Inc., 1300 Walt Whitman Road, Melville, Nueva York 11747.

Michael W. Davidson - Laboratorio Nacional de Alto Campo Magnético, 1800 East Paul Dirac Dr., Universidad Estatal de Florida, Tallahassee, Florida, 32310.


Ver el vídeo: TIPOS DE MICROSCOPIA: CONTRASTE DE FASES (Diciembre 2021).