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¿Alta tasa de renovación de proteínas e inhibidores de proteasa?


Trabajo con ratones y quiero ver qué sucede con algunas proteínas específicas en el cerebro del ratón después de la inyección de IL-1b (intracerebroventricular).

Tengo un problema: cuando mido los niveles de ARNm y proteínas, veo que hay algunas diferencias entre ellos.

Puede ser como: ARNm (regulado al alza) Proteína (sin diferencia)

¿Es posible que estas proteínas tengan una alta tasa de recambio? Si es así, ¿cómo puedo evitarlo?

¿Puedo (si es posible) inyectar (intracerebroventricular) IL-1b mezclada con inhibidores de proteasa?


Los científicos han descubierto recientemente (o han llegado a aceptar la noción) que, al menos en eucariotas, la expresión de ARNm está poco correlacionada con la expresión de proteínas. Hay varios factores que influyen en la regulación de la traducción, como siARN o microARN, secuestrar ARNm mientras se transportan a varios compartimentos celulares, entre otros. Incluso después de que se produce la proteína, puede haber factores que interfieran con su reportero de expresión. Y como mencionas, puede degradarse más rápido de lo que esperas. Las células intentan mantener las proteínas en ciertos niveles de expresión, por lo que si la IL-1b promueve la expresión sin inhibir la vía de degradación, la degradación podría acelerarse para que los niveles vuelvan a la normalidad.

Vale la pena probar algunos inhibidores de la proteasa, ya que es bastante simple en sí mismo. También debería aumentar su expresión de proteínas independientemente de si la degradación de las proteínas es su factor limitante. Si esto no funciona, o si es prohibitivamente caro sacrificar ratones mientras estás elaborando un protocolo (y suele ser así), entonces recurriría a los cultivos celulares y trataría de discernir dónde te bloquean. Ese tipo de información generalmente constituirá un documento PNAS decente por sí solo.


Fármacos inhibidores del proteasoma

Los proteasomas son grandes complejos de proteínas multicatalíticas que escinden las proteínas celulares en péptidos. Hay muchas formas distintas de proteasomas que difieren en subunidades catalíticamente activas, subunidades reguladoras y proteínas asociadas. Los inhibidores del proteasoma son una clase importante de medicamentos para el tratamiento del mieloma múltiple y el linfoma de células del manto, y se están investigando para otras enfermedades. Bortezomib (Velcade) fue el primer inhibidor del proteasoma aprobado por la Administración de Drogas y Alimentos de EE. UU. Recientemente se aprobaron carfilzomib (Kyprolis) e ixazomib (Ninlaro) y se están desarrollando más medicamentos. Si bien el mecanismo de acción principal es la inhibición del proteasoma, los eventos posteriores que conducen a la muerte celular selectiva no están del todo claros. Se ha encontrado que los inhibidores del proteasoma afectan el recambio de proteínas, pero en concentraciones que son mucho más altas que las alcanzadas clínicamente, lo que aumenta la posibilidad de que algunos de los efectos de los inhibidores del proteasoma estén mediados por otros mecanismos.


Abstracto

La tremenda diversidad funcional, espacial y temporal del proteoma vegetal está regulada por múltiples factores que modifican continuamente la abundancia, las modificaciones, las interacciones, la localización y la actividad de las proteínas para satisfacer las necesidades dinámicas de las plantas. La disección de la complejidad del proteoma y su variación genética subyacente está atrayendo cada vez más la atención de la investigación. La proteómica basada en espectrometría de masas (MS) se ha convertido en un enfoque poderoso en el estudio global de las funciones de las proteínas y sus relaciones a nivel de sistemas. Aquí, revisamos los avances recientes y las estrategias adoptadas para desentrañar la diversidad del proteoma, con un enfoque específico en los métodos utilizados para analizar las modificaciones postraduccionales (PTM), la localización de proteínas y la organización de proteínas en módulos funcionales. También consideramos la diafonía de PTM y múltiples PTM que regulan temporalmente el ciclo de vida de las proteínas. Finalmente, discutimos estudios cuantitativos recientes que utilizan la EM para medir las tasas de renovación de proteínas y examinar las direcciones futuras en el estudio del proteoma vegetal.


Resultados

La acción de los fármacos que alteran la actina en la levadura

Probamos el efecto de seis fármacos que alteran la actina sobre el crecimiento de S. cerevisiae células pipeteando diferentes concentraciones de los fármacos en discos de filtro que luego se colocaron en céspedes nacientes de células de levadura de tipo salvaje. Cytochalasin B (ver Cooper, 1987, y referencias allí), jasplakinolide (Bubb et al., 1994 Senderowicz et al., 1995) y swinholide-A (Bubb et al., 1995) no causaron zonas de crecimiento inhibido en ningún momento. concentración probada (1 μM – 1 mM Tabla II). Sin embargo, las celdas en las que ERG6 el gen ha sido eliminadoΔerg6) para aumentar la permeabilidad celular (Gaber et al., 1989), fueron sensibles a swinholide-A (Tabla III). Además, cuando el Δerg6 las células se expusieron a swinholide-A 500 µM en suspensión, todas las estructuras de actina filamentosa (F-actina) detectables mediante tinción con rodamina-faloidina se perdieron rápidamente (datos no mostrados).

LAT-A, LAT-B y mycalolide-B causaron todas zonas de crecimiento inhibido en el césped de las células de tipo salvaje (Tabla III) y todas alteraron el citoesqueleto de actina (no mostrado). Usamos LAT-A para estudios posteriores porque su mecanismo informado de inhibición del ensamblaje de actina, a través de la unión y secuestro del monómero de actina (Coué et al., 1987), se adaptaba mejor a los objetivos de nuestros estudios (ver más abajo), y porque las levaduras eran más sensibles a LAT-A que a LAT-B. Las células diploides son ligeramente más sensibles (1,7 veces) que las células haploides congénicas a LAT-A (datos no mostrados), y tanto las células haploides como las diploides muestran & lt15% de diferencia en la sensibilidad a LAT-A entre 14 ° C y 37 ° C. Finalmente, LAT-A, LAT-B y mycalolide B causaron inhibición del crecimiento de la levadura de fisión. Schizosaccharomyces pombe (Cuadro III).

El efecto de LAT-A sobre el citoesqueleto de actina en S. cerevisiae

Para determinar el efecto de LAT-A sobre la actina misma en lugar de su efecto sobre el crecimiento de las células en las placas, agregamos el fármaco a las células en suspensión a la concentración más baja a la que se formó un halo. Para esta caracterización se utilizaron células diploides porque son más grandes, lo que facilita la visualización de las estructuras de actina. Después de incubaciones de 15 min o 2 h de células en fase logarítmica en LAT-A 200 μM (o un volumen equivalente de DMSO, nuestro disolvente para LAT-A, como control) a 25 ° C, las muestras se fijaron para Rd-phalloidin tinción de estructuras filamentosas de actina. No se observaron estructuras de actina en las células en ninguno de los puntos temporales (ver Fig.1 para t = 2 h t = 15 min, datos no mostrados) indicando que LAT-A había causado una interrupción completa del citoesqueleto de actina. También teñimos estas células con anticuerpos contra la tubulina y observamos husos mitóticos y microtúbulos citoplásmicos normales en las células tratadas con LAT-A, lo que indica que el citoesqueleto de tubulina no se vio muy afectado por el fármaco (datos no mostrados).

La cinética del efecto LAT-A sugiere una alta tasa de rotación de filamentos de actina

Para determinar la tasa de ruptura del citoesqueleto de actina, se agregó LAT-A a las células y las muestras se fijaron en puntos de tiempo de 1 a 15 minutos después de la adición. A continuación, las células se tiñeron usando Rd-faloidina para observar las estructuras de F-actina. Se determinó el porcentaje de células que contienen cables de actina o parches de actina cortical (Fig.1,C). También se anotó si las estructuras corticales estaban polarizadas dentro de la célula. Los cables de actina desaparecieron rápidamente y solo el 5% de las células tenían cables observables después de 1 min. No se observaron cables después de 2 min. Se observaron parches corticales en sólo el 5% de las células después de 5 min y en & lt1% de las células después de 10 min. Curiosamente, muchos de los parches parecieron despolarizarse antes de que se desmontaran por completo. También se demostró que el efecto de LAT-A es completamente reversible con células que requieren aproximadamente 60 min para recuperar su citoesqueleto de actina polarizado normal (Fig.1 D).

La rapidez con la que se desmontan los filamentos de actina en la levadura tratada con LAT-A sugiere que los filamentos de actina se renuevan muy rápidamente en las células de levadura vivas. Sin embargo, esta conclusión se basa en la suposición de que LAT-A inhibe el ensamblaje uniéndose a los monómeros de actina y no provocando activamente el desensamblaje a través de un mecanismo como el corte del filamento. Dos líneas de evidencia reportadas por Coué et al. (1987) sugirió que LAT-A se une a los monómeros de actina para formar un complejo de ensamblaje incompetente. La primera fue la observación de un retraso cinético en la polimerización que aumentó con el aumento de la concentración de LAT-A. La segunda fue que en estado estacionario, los niveles de F-actina ensamblados en presencia de concentraciones variables de LAT-A fueron consistentes con la formación de un complejo de LAT-A: actina 1: 1 incapaz de ensamblarse.

Repetimos el análisis de Coué et al. (1987) con actina de levadura y obtuvieron resultados similares (no mostrados). Además, incubamos filamentos de F-actina por debajo de la concentración crítica para la polimerización en presencia de LAT-A (o DMSO) y monitoreamos los niveles de F-actina por dispersión de luz. Si LAT-A fuera capaz de promover activamente el desmontaje a través de un mecanismo como el corte, habríamos esperado que el nivel de F-actina cayera drásticamente cuando se incubó con el fármaco según nuestro protocolo experimental (ver Bubb et al., 1995), pero no observamos esto. Más bien, detectamos una disminución gradual en los niveles de actina F, a una tasa solo ligeramente mayor que la del control (datos no mostrados). Estos datos confirmaron que LAT-A inhibe el ensamblaje formando un complejo de ensamblaje incompetente con actina de levadura monomérica, y que no promueve activamente el desensamblaje.

Especificidad del efecto LAT-A

Como LAT-A brindó la oportunidad de determinar por primera vez las consecuencias de una falta total de actina filamentosa en la levadura, fue necesario demostrar primero la especificidad del fármaco en las células de levadura vivas. Para demostrar la especificidad de LAT-A, aprovechamos una colección congénica de mutantes de actina que se generó mediante una exploración de mutagénesis cargada a alanina de ACTO 1, el gen de actina convencional de levadura único (Wertman et al., 1992). Cada alelo de la colección expresa una forma mutante de actina como única fuente de actina en la célula. La colección, que comprende 23 cepas viables, se usó previamente para mapear los sitios de unión en la superficie de la actina para la faloidina (Drubin et al., 1993), para la fimbrina de levadura (Holtzman et al., 1994), y para varios otros asociados con actina. proteínas (Amberg et al., 1995). Las sensibilidades LAT-A de todas las cepas de la colección se compararon utilizando el ensayo de halo. Figura 2, anuncio muestra los ensayos de halo de varias cepas de la colección para ilustrar la variación en la sensibilidad entre los alelos. Además, la sensibilidad LAT-A de cada alelo se comparó con la sensibilidad de las células que contienen actina de tipo salvaje. Esta comparación se muestra gráficamente en la Fig.2 mi.

El gráfico muestra claramente que existe una gran variación en la respuesta de los diferentes alelos a LAT-A. La primera observación es que la sensibilidad LAT-A no se correlaciona con la sensibilidad a la sal o al calor (fenotipos descritos por Wertman et al., 1992). Por tanto, no se trata simplemente de que las cepas más enfermas sean las más sensibles a LAT-A. De hecho, una de las cepas más enfermizas de la colección, act1-112, que solo puede crecer entre 20 ° C y 30 ° C, y tiene un crecimiento muy restringido en medios que contienen sal, en realidad es resistente a LAT-A. En total, hubo cuatro cepas en la colección de mutantes que mostraron cierta resistencia a LAT-A. act1-119 fue parcialmente resistente, mientras que act1-112, act1-113, y act1-117 mostró una resistencia completa en todos los niveles de LAT-A probado. Los tres mutantes que eran completamente resistentes a LAT-A mostraron variaciones en sus otras propiedades fenotípicas generales. Como ya se mencionó, las células que llevan el act1-112 mutaciones están muy enfermas con un rango de temperaturas de crecimiento muy restringido. Otra cepa, que expresa mutación. act1-113, muestra una ligera sensibilidad a la temperatura y también exhibe sensibilidad a la sal a bajas temperaturas. La tercera cepa, expresando act1-117, se ha denominado una cepa de tipo pseudo-salvaje ya que puede crecer en las mismas condiciones de temperatura y concentración de sal que las células de tipo salvaje (Wertman et al., 1992).

La existencia de alelos de actina que muestran resistencia a LAT-A en un contexto por lo demás congénico fue una evidencia muy fuerte de que LAT-A estaba actuando de una manera muy específica sobre la actina en células de levadura. Sin embargo, una advertencia final fue que estas tres mutaciones de actina podrían afectar los mecanismos generales de captación de fármacos como LAT-A. Los análisis de halo realizados con otros dos fármacos, mycalolide-B y swinholide-A, indicaron que no es probable que este sea el caso. Con mycalolide-B, act1-113 y act1-117 Las células mostraron una sensibilidad similar a las células de tipo salvaje, y act1-112 de hecho, las celdas eran más sensibles (datos no mostrados). Las células de tipo salvaje son resistentes a swinholide-A en todos los niveles analizados, sin embargo, los tres mutantes resistentes a LAT-A eran sensibles a este fármaco (datos no mostrados), lo que demuestra que es poco probable que su falta de sensibilidad a LAT-A ser debido a mecanismos de captación deficientes.

Por tanto, los resultados del ensayo de halo fueron muy indicativos de una interacción específica de LAT-A con actina en células de levadura. Para investigar la posibilidad de que la resistencia se deba a la interrupción del sitio de unión de LAT-A normal en la molécula de actina, analizamos la posición de los tres alelos resistentes dentro de la estructura cristalina de actina. Como se muestra en la Fig. 3, los alelos definen un pequeño parche en actina adyacente a la hendidura de unión de nucleótidos. Residuos mutados en los tres alelos (act1-112 = K213A, E214A, K215A act1-113 = R210A, D211A act1-117 = R183A, D184A) se cree que contactan directamente a través de puentes salinos o puentes de hidrógeno, el nucleótido mismo, o forman puentes salinos para colocar otros residuos que se unen ellos mismos al nucleótido (Kabsch et al., 1990). Por lo tanto, determinamos el efecto de LAT-A sobre el intercambio de nucleótidos.

Probamos las propiedades de intercambio de nucleótidos de la actina de levadura de tipo salvaje en presencia de concentraciones crecientes de LAT-A controlando el aumento de fluorescencia observado cuando ε-ATP se une a actina. Como se muestra en la Fig. 4, la adición de LAT-A inhibe el intercambio de nucleótidos en actina de una manera dependiente de la dosis.

Como prueba final de especificidad LAT-A, purificamos actina de dos de las cepas resistentes a LAT-A, act1-113 y act1-117. No intentamos aislar la actina de act1-112 células porque están muy enfermas y, por lo tanto, pensamos que la probabilidad de que produzcan una actina suficientemente estable para permitir el análisis in vitro era baja. De hecho, la actina de un act1-113 mutante polimerizado muy mal in vitro (& lt10% podría sedimentarse en condiciones que casi cuantitativamente sedimentaron la actina de tipo salvaje polimerizada), aunque act1-113 cepas son considerablemente más saludables que act1112 son. Dado que habría sido difícil analizar los datos del montaje del act1-113 actina, procedimos con solo act1-117 actina. G-actina de ACTO 1 o acto 1-117 Se dejó que las cepas polimerizaran en ausencia o presencia de LAT-A. Se sedimentó F-actina y los sobrenadantes y sedimentos resultantes se analizaron mediante SDS-PAGE (Fig.5,a). Las bandas de proteína de actina en este gel se analizaron por densitometría (Fig.5,B). Los resultados de estos experimentos muestran que la incubación de LAT-A con una concentración equimolar de actina de tipo salvaje, pero no actina de act1117 células, resultó en la inhibición del ensamblaje de filamentos. los act1-117 la mutación en sí misma parece afectar la capacidad de la actina para formar filamentos. Sólo el 40% de act1-117 La actina se sedimentó usando las condiciones que dieron como resultado una sedimentación de & gt90% para la actina de tipo salvaje. Sin embargo, la adición de LAT-A a esta actina no afectó significativamente su capacidad para polimerizar. Para verificar que la sedimentación de la actina mutante se debió a la formación de filamentos, más que a la agregación de monómeros de actina, observamos los filamentos de actina mutante, marcados con Rh-faloidina, directamente por microscopía de fluorescencia (Fig.5 C) y encontró que tanto el tipo salvaje como act1-117 actina fueron capaces de formar filamentos, pero sólo act1-117 la actina pudo formar filamentos en presencia de LAT-A.

Efectos de LAT-A sobre el crecimiento, la viabilidad, la morfogénesis y la endocitosis

Habiendo determinado que los efectos de LAT-A sobre la actina en las células de levadura son rápidos, reversibles y específicos, a continuación determinamos cómo la interrupción total de los filamentos de actina afectaría los procesos celulares. El crecimiento de las células en medio rico se controló mediante el recuento de células después de la adición de LAT-A (Fig.6,a). Después de la adición del fármaco, casi no hubo aumento en el número de células. Sin embargo, cuando se evaluó el crecimiento celular midiendo la turbidez (DO 600 nm), hubo un aumento después de la adición de LAT-A a aproximadamente 2.5 veces la lectura original de DO (Fig.6,B). Esto indicó un crecimiento en el volumen celular que no se correspondía con el aumento del número de células. Los alelos mutantes act1-113 y act1-117 también se evaluó el crecimiento en presencia de LAT-A. Ninguna cepa mostró una alteración detectable de su tasa de crecimiento en presencia del fármaco (Fig.6, C y D). Además, ambos act1-113 y act1-117 los mutantes se tiñeron para F-actina en presencia de LAT-A. Los parches de actina cortical estaban claramente presentes en estas células durante el transcurso de 1 h (datos no mostrados).

La viabilidad de las células después del tratamiento con LAT-A 100 μM se evaluó contando el número de células tratadas que podrían formar colonias después de una incubación programada (Fig.6 mi). Las células se trataron con LAT-A en suspensión, se golpearon sobre una placa y se disecaron 120 células de esta población usando un micromanipulador. Se evaluó la capacidad de cada célula manipulada para formar una colonia. La viabilidad de las células después de la adición de LAT-A no disminuyó significativamente durante el transcurso de tiempo de 4 h, con el 93% de las células tratadas durante 4 h con LAT-A capaces de formar colonias aparentemente normales cuando se colocaron en placas. En la población de control de células que no se trataron con LAT-A, todas las colonias que se formaron tenían aproximadamente el mismo tamaño. En cada punto de tiempo después de la adición de LAT-A, del 2 al 5% de las colonias eran mucho más pequeñas que en el caso de control, siendo solo visibles a simple vista (datos no mostrados).La razón de las pequeñas colonias no está clara. Es posible que sean pequeñas con la pérdida temporal de F-actina afectando de alguna manera la herencia del genoma mitocondrial.

Habiendo establecido que la viabilidad celular se mantuvo alta durante períodos prolongados en LAT-A, ahora podríamos usar el fármaco para analizar los efectos sobre la fisiología celular. Por lo tanto, primero buscamos efectos sobre la morfogénesis celular y observamos que durante la incubación en LAT-A las células aumentan considerablemente de tamaño pero no se detienen con una morfología uniforme. Cuando se evaluó durante un curso de tiempo de 4 h, se observó que el porcentaje de células sin brotes aumentaba del 38% sin brotes en ausencia de LAT-A (39% con brotes pequeños y 23% con brotes grandes) al 77% sin brotes en presencia de LAT- A (12% de brotes pequeños, 11% de brotes grandes) que demuestra defectos en la formación de brotes. Además, muchas células detenidas contenían yemas que todavía estaban adheridas a la célula madre. Estas yemas podrían separarse de las células madre mediante digestión enzimática de la pared celular, lo que indica que la actina no es necesaria para la citocinesis, pero sí para la degradación completa del material del tabique entre las células madre e hija.

Se ha demostrado que la endocitosis en levaduras depende de la presencia de un citoesqueleto de actina intacto (Kübler y Riezman, 1993). Evaluamos la endocitosis controlando la captación del marcador de fase fluida amarillo lucifer (LY Dulic et al., 1991). En ausencia de LAT-A, hay una captación específica de LY en las vacuolas. Sin embargo, en presencia de LAT-A, mientras que las vacuolas todavía eran visibles por la óptica de Nomarski, no había captación de LY, lo que indica inhibición de la endocitosis (datos no mostrados).

La sensibilidad a LAT-A de las cepas con un citoesqueleto de actina alterado

Para obtener nuevos conocimientos sobre el papel de las proteínas del citoesqueleto de actina en la modulación de la integridad y función del citoesqueleto, investigamos el efecto sobre la sensibilidad LAT-A de mutaciones en genes que codifican varias proteínas que son importantes para la función del citoesqueleto de actina. Realizamos ensayos de halo en cada cepa mutante y también en la cepa parental congénica. Este control fue necesario porque notamos alguna variación en la sensibilidad de LAT-A entre cepas de tipo salvaje de diferentes antecedentes de cepas. Hubo una variedad de sensibilidades de las células mutantes a LAT-A cuando se evaluaron mediante ensayos de halo. Dos mutantes mostraron una ligera resistencia a LAT-A. Estos llevaban una supresión de la SLA1 gen, y una mutación en el END3 genend3-1), con proporciones de sensibilidades aparentes en comparación con los controles de 0,5 y 0,3, respectivamente (ver Materiales y Métodos). Varios mutantes mostraron una mayor sensibilidad a LAT-A, incluyendo Δsrv2, Δcap2, Δtpm1, Δsac6p, y Δsla2 con proporciones de sensibilidades aparentes de 2.9, 4.0, 2.8, 1.8 y 2.6, respectivamente. Cepas que llevan el Δabp1 La mutación mostró un aumento de resistencia apenas detectable. Estos resultados destacan las diferencias entre las proteínas del citoesqueleto en sus contribuciones a la estabilidad del citoesqueleto.

El papel de la actina en el desarrollo de la polaridad en el presunto sitio de la yema

Utilizamos la sensibilidad a LAT-A para determinar cuál de las 19 proteínas que normalmente se localizan en el presunto sitio de la yema dependen de un citoesqueleto de actina intacto para su localización. Usamos células diploides porque son más sensibles que los haploides a LAT-A, su mayor tamaño facilita las observaciones realizadas por microscopía de inmunofluorescencia y tienen una forma elipsoidal que permite distinguir los extremos de una célula. Ser capaz de identificar los extremos de una célula es importante para poder determinar si un sitio de yema se ha formado en la posición correcta (ver Drubin y Nelson, 1996). Las células fueron liberadas de G0, como se describe en Materiales y métodos, en presencia o ausencia de LAT-A. En cada momento, se utilizó inmunofluorescencia para localizar las proteínas de interés.

La actina es necesaria para la formación de yemas en las células que salen de G0

Para establecer una línea de base para las comparaciones, determinamos la velocidad a la que se logró la polarización de la actina en las células que salen de G0. Los puntos de tiempo por hora se tomaron de G0 células liberadas en medios frescos en presencia o ausencia de LAT-A. Figura 7,a muestra el porcentaje de células con tinción de actina polarizada obtenido por este procedimiento. La polarización de la tinción de actina en ausencia de LAT-A fue clara después de 2 h y aumentó a un pico de 80% de células con tinción polarizada después de 4 h. En cursos de tiempo más largos, el número de células con tinción polarizada no superó el 80%, presumiblemente porque el nivel de sincronía en las células no era lo suficientemente alto (es decir, las células restantes están en G temprano1 o tarde G2/ mitosis, etapas en las que se despolariza el citoesqueleto de actina cortical). Figura 7,C muestra el patrón de tinción de inmunofluorescencia anti-actina para células después de 4 h de crecimiento siguiendo la G0 lanzamiento en ausencia de LAT-A. Durante este período de 4 h, también se controló la morfología celular. Aunque el crecimiento en cultivo después de la liberación no fue completamente sincrónico, hubo un enriquecimiento significativo para las células de brotes pequeños a las 2-3 h después de la liberación, y para las células de brotes medianos a grandes a las 4 h después de la liberación (Fig.7 B).

En presencia de LAT-A no hubo polarización observable del citoesqueleto de actina en ningún momento (Fig.7, a y D). En los primeros momentos (0-1 h), no se observaron estructuras de actina. Sin embargo, después de esta etapa, un número creciente de células contenían barras de actina (Fig.7 D). Barras similares se han informado previamente en cepas mutantes que tienen defectos de actina (Johnston y col., 1991 Holtzman y col., 1993 Welch y Drubin, 1993). Las barras de actina no se tiñen con el colorante de tinción de F-actina rodamina-faloidina y, por lo tanto, se ha propuesto que son agregados de actina monomérica. En los puntos de tiempo posteriores, también se pueden ver puntos más pequeños de tinción de actina que parecen ser de tamaño similar a los parches corticales. Sin embargo, estos agregados no se marcan con Rd-faloidina ni, en la mayoría de los casos, parecen estar en la corteza, lo que indica que estas estructuras son más probablemente agregados de actina monomérica. Además, en un pequeño porcentaje de células (& lt5%), se observó que la actina se tiñe dentro del núcleo.

Debido a que no se pudo detectar actina filamentosa en las células tratadas con LATA, se podría concluir que cualquier proteína que pudiera lograr un patrón de tinción polarizada en presencia de LAT-A lo estuviera haciendo en ausencia de F-actina.

Proteínas de establecimiento de polaridad, Cdc42p y Bem1p

Para determinar si el citoesqueleto de actina tiene algún papel en la etapa temprana del establecimiento de polaridad que implica la localización de Cdc42p y Bem1p en la corteza celular, analizamos la localización de Cdc42p y Bem1p al salir de G0 en presencia o ausencia de LAT-A. Como se muestra en la Fig.8, a y D, en ausencia de LAT-A, Cdc42p y Bem1p se polarizaron con cinéticas similares a la actina. Como se informa en la literatura (Ziman et al., 1993 Pringle et al., 1995), ambas proteínas mostraron tinciones altamente localizadas en el sitio presuntivo de la yema y en la punta de las yemas pequeñas (Fig.8, B y mi). En células con cogollos más grandes, la tinción fue más difusa pero aún polarizada. También se observó tinción en el cuello de la yema madre antes de la citocinesis.

En ausencia o presencia de LAT-A, Cdc42p y Bem1p lograron una localización celular polarizada y lo hicieron con una cinética similar (Fig. 8). En las células tratadas con LAT-A, la tinción se realizó en forma de un punto brillante en un extremo de la célula diploide elipsoidal (Fig.8, C y F) que era la posición adecuada para la formación del sitio de la yema. En el caso de la localización de Cdc42p en presencia de LAT-A, además de la mancha brillante de tinción en el extremo de la célula, también se pudo observar un nivel bajo de tinción cortical difusa. Para abordar aún más si la localización polarizada de Bem1p y Cdc42p reflejaba elementos de una vía natural para el presunto ensamblaje del sitio de la yema, realizamos un marcado doble con anticuerpos para otra proteína presunta del sitio de la yema, Cdc11p (consulte la siguiente sección para obtener una descripción de la localización de Cdc11p en LAT- A). Los patrones de tinción de las proteínas son diferentes, se observa un pequeño parche de tinción para Cdc42p o Bem1p, mientras que se observa un anillo para la tinción de Cdc11p, por lo que se pueden distinguir los patrones de tinción. En presencia de LAT-A, se pudo observar que la tinción era coincidente (un anillo Cdc11p rodeaba el parche Cdc42p o Bem1p) en el 99% de las células (400 células contadas), lo que sugiere además que Cdc42p, Bem1p y Cdc11p se habían localizado en lo que era un sitio de yema natural excepto por la ausencia de actina y proteínas asociadas.

Proteínas de unión a actina y proteínas implicadas genéticamente en la función de la actina

La localización polarizada de las proteínas de unión a actina Abp1p y cofilina en células liberadas de G0 se encontró que dependía de la presencia de estructuras de actina F. El porcentaje de células con tinción polarizada en presencia y ausencia de LAT-A se cuantificó para cada proteína y estos datos se ilustran gráficamente en la Fig. 13. En contraste, tanto Sla1p como Sla2p que también colocalizan con estructuras corticales de actina (Holtzman et al. ., 1993 Ayscough, K. y S. Yang, observaciones no publicadas), pudieron localizarse en la corteza celular y estaban en estructuras en forma de parche en ausencia de F-actina (datos no mostrados). En una pequeña población de células, estas proteínas parecían tener una distribución polarizada.

En ausencia de LAT-A, Aip3p / Bud6p, una proteína que interactúa con la actina de levadura en un cribado de dos híbridos y que se localiza en sitios corticales (Amberg et al., 1996), logró su patrón de tinción polarizada normal observándose tinción. en el presunto sitio de la yema, en la punta de la yema y, en células grandes con yemas, en el cuello de la yema madre (ver la Fig. 13 anterior). En presencia de LAT-A, se redujo el número de células que mostraban tinción localizada. Sin embargo, estaba claro que en un número significativo de células, Aip3p / Bud6p todavía podía localizarse en la corteza celular y, en muchos casos, mostraba una localización polarizada. El 22% de las células mostró tinción polarizada en los extremos de la célula (Fig.13) mientras que en otros casos, la tinción se limitó a parches discretos que no estaban al final de las células elipsoidales (3,5%), o había dos parches en la corteza con al menos un parche que no está al final de la célula (9,5%).

Kelleher (1995) propuso que un heterodímero Arp2 / Arp3 podría servir como núcleo para la polimerización de actina. Por tanto, era de interés determinar si Arp2 en levadura podría funcionar independientemente de la actina y lograr su localización polar normal en ausencia de actina convencional. En ausencia de LAT-A, Arp2p tiene un patrón de tinción tipo parche cortical polarizado (Moreau et al., 1996) con cinética de localización similar a la actina. Sin embargo, en presencia de LAT-A, Arp2p no se polarizó, aunque mostró una distribución diferente de la actina (ver Fig. 13 para un resumen de los datos). En presencia de LAT-A, la actina, pero no Arp2p, se localiza en las estructuras de las barras y, en algunos casos, en el núcleo. En contraste con la actina, una cantidad significativa de tinción con Arp2 parecía estar asociada con la corteza celular donde su tinción era difusa. Esto fue particularmente evidente en los primeros momentos (1 a 2 h) después de la liberación de células de G0.

Proteínas involucradas en procesos secretores

Localizamos varias proteínas (Sec4p, Sec8p, Myo2p, calmodulina y Smy1p) implicadas en la secreción en ausencia y presencia de LAT-A. Sec4p es un miembro de la familia de proteínas Rab-GTPasa y actúa en una etapa tardía de la vía secretora entre el aparato de Golgi y la membrana plasmática (Salminen y Novick, 1987). Sec4p se localiza en el presunto sitio de la yema y en la punta de las células de pequeños brotes (Novick y Brennwald, 1993). Sec8p es un componente de un complejo proteico que se localiza en el presunto sitio de la yema y la punta de la yema, y ​​puede estar involucrado en el acoplamiento de vesículas en la membrana plasmática (TerBush y Novick, 1995 TerBush, D., comunicación personal). Myo2p es una miosina no convencional con calmodulina como subunidad asociada (Johnston et al., 1991 Brockerhoff et al., 1994). Las mutaciones en Myo2p y calmodulina pueden causar acumulación de vesículas, síntesis de la pared celular deslocalizada, deposición de quitina y, a menudo, una detención como células no adheridas (Johnston et al., 1991 Brockerhoff y Davis, 1992 Brockerhoff et al., 1994 Lillie y Brown, 1994 Govindan, et al. al., 1995). Smy1p es una proteína similar a la cinesina que se identificó como un supresor de dosis de una mutación en MYO2. (Lillie y Brown, 1994).

Encontramos que la actina es necesaria para la localización de Sec4p, Sec8p y Smy1p en el presunto sitio de la yema. Por el contrario, tanto Myo2p como calmodulina pudieron localizarse en esta región en ausencia de actina, aunque en menor grado que en las células de control. Se muestran ejemplos de datos cinéticos y fotográficos para Sec4p y calmodulina (Figuras 9 y 10). En células que crecen a partir de G0, Sec4p se volvió altamente polarizado en el sitio presuntivo de la yema, permaneciendo en la punta de la yema en células de yemas pequeñas y luego volviéndose un poco más difuso a medida que la yema crece. No era claramente visible en la mayoría de las células de brotes medianos a grandes, pero se observó en el cuello del brote madre antes de la citocinesis (Fig.9, a y B). Sin embargo, cuando se añadió LAT-A al medio de crecimiento durante la salida de la fase estacionaria, Sec4p no mostró localización polarizada (Fig.9, a y C).

En ausencia de LAT-A, calmodulina y Myo2p se localizaron en el presunto sitio de la yema, la punta de las células de pequeñas yemas y la región septal. La tinción en células de brotes medianos a grandes fue más tenue (Fig.10, a y B solo se muestran los datos de calmodulina ya que la tinción de Myo2p fue esencialmente idéntica). En presencia de LAT-A, hubo un alto nivel de tinción citoplásmica y la mayoría de las células no mostraron polarización de tinción. Sin embargo, en aproximadamente el 30% de las células, la calmodulina apareció en un parche discreto ubicado al final de la célula elipsoidal, una posición que es apropiada para el sitio de la yema (Fig.10 C). Cuando las células se siguieron durante más de 4 h, el número de células con este patrón de tinción aumentó ligeramente pero no se elevó por encima del 35% de las células observadas.

Proteínas necesarias para la citocinesis

Varias proteínas se localizan en el presunto sitio de la yema, pero son más importantes para los procesos que ocurren después de la formación de la yema. Las septinas de levadura, requeridas para la citocinesis y propuestas como subunidades de los filamentos observados en el cuello de la yema madre por microscopía electrónica, son tales proteínas (Hartwell, 1971 Haarer y Pringle, 1987 Ford y Pringle, 1991 Kim et al., 1991) .

Examinamos la localización de dos proteínas septin, Cdc10p y Cdc11p. Debido a que los resultados fueron indistinguibles para estas dos proteínas, solo hemos presentado los datos para Cdc11p. Tanto en ausencia como en presencia de LAT-A, Cdc11p se polarizó y la cinética de localización fue similar (Fig. 11). El patrón de tinción fue una estructura de anillo brillante en el presunto sitio de la yema. En ausencia de LAT-A, se observó que las células con brotes más grandes contenían un doble anillo de tinción en el cuello del brote (Fig.11,B). Al dividir las células, un anillo parecía permanecer con la madre y el otro con la célula hija. En presencia de LAT-A, solo se observaron anillos individuales, lo que indica que la duplicación de anillos depende de la formación de yemas (Fig.11 C).

Otras proteínas del sitio pre-brote

Varias otras proteínas se han localizado en el presunto sitio de la yema, pero sus actividades celulares no se comprenden actualmente lo suficientemente bien como para permitir su clasificación funcional.

Gin4p y Bni4p se localizan en una estructura de anillo en el presunto sitio de la yema que persiste en el cuello madre-yema durante todo el crecimiento de la yema (Longtine, M., D. DeMarini, J. Pringle, comunicación personal). En presencia de LAT-A, tanto Gin4p como Bni4p lograron una localización polarizada (Fig. 13).

Spa2p se localiza en el presunto sitio de la yema y en la punta de las proyecciones de apareamiento (Snyder, 1989 Snyder et al., 1991). Celdas eliminadas para SPA2 no presentan defectos en la capacidad de brotar, pero muestran un defecto en la selección del sitio de las yemas (Snyder, 1989). En ausencia de LAT-A, Spa2p se polarizó con cinéticas similares a la actina (Fig.12, a y B). En presencia de LAT-A, Spa2p aún podía polarizar. Sin embargo, la cinética de polarización se retrasó (Fig.12, a y C). En tres experimentos separados, la localización polarizada de Spa2p fue siempre 1-2 h más lenta que en ausencia de LAT-A.

El papel de la actina en el mantenimiento de la polaridad celular

Para determinar si la actina juega un papel en el mantenimiento del eje de la polaridad celular, liberamos células tanto haploides como diploides de la fase estacionaria a una etapa en la que más del 50% de las células tenían brotes pequeños. Luego tratamos estas células con LAT-A durante 5 minutos para romper completamente el citoesqueleto de actina, lavamos las células y permitimos que reanudaran su crecimiento. A las 2 h analizamos la morfología de las células (fig. 14). Tanto para las células haploides como para las diploides, la alteración del citoesqueleto de actina provocó que un porcentaje significativo de células se volvieran de dos brotes. Curiosamente, en casi todos los casos, esta segunda yema se colocó correctamente con respecto a la posición esperada de la selección del sitio de la yema. Es decir, las yemas haploides estaban adyacentes entre sí y las yemas diploides estaban en ambos polos o en el mismo polo de la célula (para una discusión de los patrones de gemación, ver Drubin y Nelson, 1996).

En un conjunto similar de experimentos, MAT haploidea las células fueron expuestas al factor α hasta que más del 90% de la población formó una proyección de apareamiento. Luego, la población se expuso a LAT-A durante 5 minutos para romper completamente el citoesqueleto de actina, se lavó y se liberó en un medio nuevo. El factor α estuvo presente en todas las etapas. En una población de control a la que se añadió DMSO en la etapa intermedia, se observaron dos shmoos en el 19% de las células. Por el contrario, el 53% de las células expuestas a LAT-A contenían dos shmoos.


Abstracto

El aumento de la resistencia de las bacterias gramnegativas a los antibióticos se está convirtiendo en un problema mundial y se requieren nuevas clases de antibióticos con nuevos mecanismos de acción. La subunidad P de proteasa caseinolítica (ClpP) es una serina proteasa conservada entre las bacterias que se considera un objetivo farmacológico interesante. La función de ClpP está involucrada en el recambio de proteínas y la homeostasis, la respuesta al estrés y la virulencia, entre otros procesos.El objetivo de este estudio fue identificar nuevos inhibidores de Escherichia coli ClpP y comprender su modo de acción. Se probó una biblioteca enfocada de inhibidores de serina proteasa basada en ojivas de diarilfosfonato para la inhibición de ClpP, y se llevó a cabo una exploración química alrededor de los compuestos afectados. En total, 14 nuevos potentes inhibidores de E. coli Se identificaron ClpP. Compuestos 85 y 92 surgieron como compuestos más interesantes de este estudio debido a su potencia y, respectivamente, a sus propiedades antibacterianas moderadas pero consistentes, así como al perfil de citotoxicidad favorable.


2.1. Catepsinas

Las catepsinas de cisteína son principalmente proteasas lisosomales intracelulares que son responsables del recambio de proteínas, pero han demostrado estar reguladas al alza en el cáncer, a menudo en lesiones tempranas [19]. La escisión del sustrato catalizada por catepsina generalmente implica cisteína nucleofílica tiol, histidina y un aspartato en el sitio activo y la escisión se ve favorecida por las condiciones ácidas [16]. Sin embargo, es necesario determinar los sustratos específicos de las catepsinas de cisteína implicadas en condiciones patológicas [19]. Las catepsinas de cisteína sobreexpresadas están implicadas en glioma [20-21], melanoma [22], cáncer de esófago [23], estómago [24], colon [25], próstata [26-27], mama [28] y pulmón [ 29] y se han utilizado como biomarcadores patológicos [30]. Las catepsinas de cisteína activas se encuentran más comúnmente en las condiciones ácidas de los lisosomas, con algunas excepciones. La catepsina K normalmente se excreta al espacio extracelular entre los osteoclastos y el hueso para la remodelación ósea [31-32]. Aunque las proteasas intracelulares están menos estudiadas en su papel en el cáncer en comparación con las proteasas degradantes de ECM más comunes como MMP y uPA, la desregulación en sus ubicaciones puede iniciar más cascadas proteolíticas extracelulares [33-34]. Por ejemplo, la catepsina B y L secretada hidrolizan el colágeno tipo IV, la fibronectina [35], las proteínas de adhesión celular [36] y la laminina [35] para permitir la proliferación de células tumorales e instigar pro-MMP. Las catepsinas de cisteína también pueden degradar el colágeno mediante proteólisis intracelular. El colágeno puede ser absorbido por macrófagos y células tumorales a través de uPA y uPAR y luego degradado en los lisosomas por cisteína catepsinas [19]. Se ha demostrado que las catepsinas más investigadas, las catepsinas B y L, se sobreexpresan mediante amplificación de genes, variantes de transcripción expresadas por células tumorales, factores de transcripción y regulación postranscripcional [37]. La catepsina B se ha identificado en las caveolas de la membrana, fuera del lisosoma, de las células de cáncer de colon humano y se ha formulado la hipótesis de que mediará en otros eventos proteolíticos que degradan la ECM y la superficie celular [38]. Trabajos recientes han demostrado que la permeabilización de la membrana lisosomal está implicada en el cáncer, principalmente debido a la descarga de muchas catepsinas de cisteína desde su ubicación innata [39]. Una vez que las catepsinas salen de la célula y entran en el entorno extracelular de los tumores, pueden ser activadas por las condiciones ácidas que se encuentran en el microambiente del tumor [40]. Sin embargo, también son posibles diferentes mecanismos de activación. Se ha demostrado que la catepsina K es activada por los glicosaminoglicanos, mientras que las catepsinas B, L y S se secretan en forma activa [41]. Curiosamente, las catepsinas de cisteína, como las catepsinas B, H, L, S y K [42], se trasladan al citosol intracelular sin asociación de membrana para iniciar la apoptosis [43-44]. Algunas catepsinas han mostrado funciones protectoras [2], como la catepsina L [45]. Por lo tanto, la activación de profármacos por catepsinas puede resultar un buen enfoque para la administración de fármacos contra el cáncer sobre las terapias que inhiben las proteasas, que son relevantes para la función celular normal. La sobreexpresión de la cisteína catepsina está bien documentada en muchas formas agresivas de cáncer [46], lo que brinda a los conjugados fármaco-catepsina sustrato la oportunidad de activarse en entornos cancerosos y administrar quimioterápicos directamente en el lugar de necesidad.

La catepsina E y la catepsina D lisosomal son proteasas aspárticas homólogas que desempeñan un papel igualmente importante en el recambio de proteínas en la célula como las catepsinas de cisteína. Las proteasas aspárticas se componen de 14 familias, pero todas suelen existir en condiciones muy ácidas, como en los lisosomas o en el tracto digestivo. La catepsina D se encuentra en el lisosoma y está implicada en el cáncer de próstata [47], mama [48] y colorrectal [49]. La expresión y secreción de catepsina D son paralelas a muchas de las cisteína proteasas lisosomales mencionadas anteriormente. La catepsina E, por otro lado, no se encuentra en los lisosomas sino en el espacio intracelular como estructuras endosomales, retículo endoplásmico y aparato de Golgi, así como en la membrana plasmática y predominantemente asociada con células inmunes [50]. La sobreexpresión de catepsina E se ha asociado con varias formas de cáncer, como los adenocarcinomas gástrico [51], cervical [52], pancreático [53-54] y carcinomas pulmonares humanos [55]. Hasta la fecha, la mayoría de los PAP desarrollados se centran en la catepsina B debido a su expresión en los lisosomas intracelulares.


Discusión

El sistema inmunológico innato es la primera línea de defensa contra patógenos extraños y varios componentes celulares y moleculares están involucrados en este proceso (Liu et al., 2016 Huang et al., 2019). Las modificaciones postraduccionales también son importantes reguladores de la inmunidad y esto incluye la ubiquitinación (Liu et al., 2016). La ubiquitina es un polipéptido de 76 aminoácidos que puede interactuar covalentemente con proteínas diana y la ubiquitina misma puede experimentar ubiquitinación en ciertos residuos (Ciechanover et al., 2000 Pickart, 2001 Jiang y Chen, 2011). Esto da como resultado la formación de cadenas de poliubiquitina unidas a lisina o cadenas de poliubiquitina lineales (Heaton et al., 2015). Es bien conocido que la poliubiquitilación unida a lisina 48 (K48) promueve la degradación proteasomal de las proteínas diana (Ciechanover et al., 2000). Por el contrario, la poliubiquitilación ligada a lisina 63 (K63) se ha implicado en procesos celulares como la respuesta al daño del ADN, la inflamación y la endocitosis (Panier y Durocher, 2009 Erpapazoglou et al., 2014 Zhou Z. et al., 2020). También es importante señalar que se están explorando otros tipos de enlaces de cadena de poliubiquitina y que las modificaciones de ubiquitina pueden conducir a diferentes resultados celulares (Komander y Rape, 2012 Ohtake et al., 2018).

Además, las deubiquitinasas humanas (DUB) son enzimas que eliminan las modificaciones de ubiquitina y contribuyen a la homeostasis (Li et al., 2016). Los virus dependen de las células huésped para su supervivencia y, para completar su ciclo de vida, han desarrollado estrategias para evadir la respuesta inmune antiviral (Nelemans y Kikkert, 2019). Curiosamente, se ha descubierto que varias proteínas virales poseen actividad desubiquitinante y pueden usarse para antagonizar o modular la vía de señalización inmunitaria antiviral (Kumari y Kumar, 2018).

La actividad desubiquitinante del SARS-CoV-2 PL pro fue el foco principal de este estudio y se utilizó la estructura cristalina de PL pro en el complejo con ubiquitina propargilamida (Klemm et al., 2020). Además de esto, se evaluaron otras cuatro estructuras cristalinas de SARS-CoV-2 que estaban disponibles en RCSB PDB. Las estructuras cristalinas del aldehído pro -ubiquitina de SARS-CoV PL y los complejos de pro -ubiquitina MERS-CoV PL se utilizaron para la comparación (Bailey-Elkin et al., 2014 Ratia et al., 2014). El acoplamiento molecular permitió predecir y examinar las propiedades de unión de los compuestos al sitio objetivo conocido de los inhibidores basados ​​en naftaleno.

GRL-0617 fue el control y anteriormente se ha encontrado que inhibe de forma potente el SARS-CoV y el SARS-CoV-2 PL pro de una manera no covalente (Ratia et al., 2008 Freitas et al., 2020 Shin et al. , 2020). El inhibidor de GRL-0617 ocupa los bolsillos S3 y S4 del SARS-CoV y del SARS-CoV-2 PL pro (Ratia et al., 2008 Gao et al., En prensa). Según los resultados del acoplamiento molecular del estudio actual, GRL-0617 estaba rodeado predominantemente por residuos hidrófobos en las estructuras cristalinas del SARS-CoV y del SARS-CoV-2 (Figura 1 y Figuras complementarias 3 & # x020136) (Ratia et al., 2008). ). Se predijo que este ligando formaría contactos interatómicos con los residuos de proteína y esto incluía D164 en la estructura 6wuu SARS-CoV-2, así como Q269 en la estructura 7jrn SARS-CoV-2. En la estructura cristalina determinada por Gao et al., Se encontró que GRL-0617, que era el ligando cocristalizado, formaba enlaces de hidrógeno con estos residuos críticos (Gao et al., En prensa). Al decir esto, se encontró que D164 y Q269 rodean a GRL-0617 en las estructuras 6xaa, 6w9c y 6wx4 del SARS-CoV-2 PL pro.

GRL-0617 también interactuó con Y268 en el SARS-CoV-2 PL pro y los contactos interatómicos estuvieron presentes con este residuo en algunas estructuras. Curiosamente, se descubrió que el inhibidor 3k a base de naftaleno forma consistentemente contactos interatómicos con Y264 en todas las estructuras cristalinas del SARS-CoV-2 (Figura 2 y Figuras complementarias 3 & # x020136) (Bosken et al., 2020). También se formaron enlaces intermoleculares entre 3k y D164 en tres de las proteasas similares a papaína del SARS-CoV-2, así como Y268 en la estructura 6wx4 (Bosken et al., 2020). Bosken y col. han identificado que estos residuos juegan un papel importante en el modo de unión de 3k (Bosken et al., 2020).

Las diferencias observadas en los enlaces intermoleculares pueden deberse a las conformaciones del dominio de los dedos y el bucle BL2 en las estructuras cristalinas de PL pro (Figura 1) (B & # x000E1ez-Santos et al., 2015). En las proestructuras de SARS-CoV-2 y SARS-CoV PL pro, el bucle BL2 corresponde a los residuos 267-272 (Lee et al., 2015 Gao et al., En prensa). En la estructura pro de MERS-CoV PL utilizada en este estudio, el bucle BL2 está compuesto por los residuos 1.752 & # x020131.758 (Bailey-Elkin et al., 2014 Lee et al., 2015). La importancia estructural del bucle BL2 (bucle de bloqueo) se ha discutido en varios artículos y se ha destacado su flexibilidad (B & # x000E1ez-Santos et al., 2015 Bosken et al., 2020 Klemm et al., 2020). Se han observado cambios de conformación en el bucle BL2 y en la literatura se han informado conformaciones & # x0201Copen & # x0201D o & # x0201Cclosed & # x0201D (B & # x000E1ez-Santos et al., 2015). Con respecto al MERS-CoV, existen diferencias estructurales significativas en el bucle BL2 y se ha sugerido que esto afecta la especificidad del reconocimiento del inhibidor (Lee et al., 2015).

GRL-0617 es ineficaz contra MERS-CoV y en el estudio de Shin et al., Se discutió que esto puede deberse a la presencia de un residuo de treonina en lugar de tirosina en una posición conservada (Lee et al., 2015 Shin et al. al., 2020). En las secuencias pro de SARS-CoV-2 y SARS-CoV PL pro, los residuos correspondientes son Y268 e Y269, respectivamente (Shin et al., 2020). Y268 es necesario para el efecto inhibidor de GRL-0617 y Shin et al. demostraron que la mutación de este residuo reduce fuertemente su potencia (Shin et al., 2020). Si bien en este estudio se predijo que GRL-0617 y 3k se unirían al MERS-CoV PL pro (4rf0), es posible que se requiera un acoplamiento adicional a estructuras cristalinas adicionales para la comparación (Figuras 1, 2). Los inhibidores basados ​​en naftaleno estaban rodeados por los residuos D165, Y269 y Q270 en el SARS-CoV PL pro. Ratia y col. y B & # x000E1ez-Santos et al., también han descrito la importancia de estos residuos en los mecanismos de acción de estos ligandos (Ratia et al., 2008 B & # x000E1ez-Santos et al., 2014).

En particular, se predijo que los compuestos dietéticos (-) - galato de epigalocatequina, hipericina, rutina y cianidin-3-O-glucósido se unirían más fuertemente al sitio inhibidor de naftaleno del SARS-CoV-2, SARS-CoV y MERS -Proteasas de tipo papaína CoV que los inhibidores conocidos (Figura 2 y Figuras complementarias 3 & # x020136). También formaron múltiples interacciones con los residuos de proteínas clave en comparación con GRL-0617 y 3k. De manera similar, los resultados del acoplamiento ciego en las principales cadenas PL pro mostraron que estos ligandos naturales tenían múltiples poses dentro de esta región (Figura 3 y Figuras complementarias 1, 2). (-) - El galato de epigalocatequina, la rutina y la cianidin-3-O-glucósido son flavonoides, una clase biológicamente activa de compuestos fenólicos (Bonvino et al., 2018). En una revisión bibliográfica reciente realizada por Verma et al., Se descubrió que los flavonoides son la clase más grande de compuestos con actividad potencial contra los coronavirus (Verma et al., 2020).

En 2005, Li et al. publicó un estudio sobre las actividades antivirales de compuestos naturales contra el SARS-CoV (Li et al., 2005). La licorina se identificó como un potente compuesto antiviral y potencialmente un candidato para el desarrollo de nuevos medicamentos (Li et al., 2005). Los compuestos naturales se han examinado por su capacidad para dirigirse a las proteínas del SARS-CoV-2. Esto incluye extractos de hierbas medicinales y varios estudios se han centrado en sus efectos inhibidores sobre proteínas clave, como la glicoproteína de pico y la proteasa principal (M pro) (Mani et al., 2020 Pitsillou et al., 2020 Russo et al., 2020 Smith y Smith, 2020). En un artículo reciente de Alamri et al. Se utilizó un enfoque computacional basado en estructura para identificar compuestos que pueden actuar como inhibidores de pan-PL pro y podrían desarrollarse más como agentes antivirales (Alamri et al., en prensa). Dada la situación actual, en silico Los métodos han hecho posible el cribado de grandes bibliotecas de compuestos aprobados existentes de una manera relativamente rápida (Ojha et al., 2020). Las estructuras de los aciertos identificados a partir de estos estudios computacionales podrían optimizarse como parte del proceso de descubrimiento de fármacos (Ojha et al., 2020). Además de los compuestos farmacológicos sintéticos, los componentes de las hierbas se pueden analizar de la misma manera y este método se ha descrito en muchos artículos (Bhowmik et al., 2020 Chikhale et al., 2020 Ghosh et al., 2020 Gupta et al., 2020 Jena et al., 2020 Krupanidhi et al., 2020 Muhseen et al., 2020 Sinha et al., 2020 Subbaiyan et al., 2020). Varios estudios que se pueden encontrar en la Plataforma de Registro Internacional de Ensayos Clínicos de la Organización Mundial de la Salud también involucran compuestos de origen vegetal, particularmente flavonoides.

Ratia y col. determinaron la estructura cristalina de SARS-CoV en complejo con ubiquitina aldehído y describieron cómo este polipéptido interactúa con las regiones de la palma y los dedos de PL pro (Ratia et al., 2014). Hicieron hincapié en que una cantidad significativa de la energía de unión de la ubiquitina se puede atribuir a sus residuos C-terminales (R72-G76) y que esta porción de ubiquitina forma una gran cantidad de enlaces de hidrógeno intermoleculares con PL pro (Ratia et al., 2014 ). Los resultados de su estudio también indicaron que el SARS-CoV PL pro tenía preferencia por la ubiquitina ligada a K48 y la ISG15, sobre las cadenas de poliubiquitina K63 y la monoubiquitina (Ratia et al., 2014). En particular, se caracterizaron dos sitios de reconocimiento en la superficie de PL pro y se definieron como SUb1 o SUb2 (Ratia et al., 2014).

En el procomplejo SARS-CoV-2 PL pro, la ubiquitina propargilamida se encuentra en los mismos subdominios que la estructura del SARS-CoV (regiones de la palma y los dedos), y el extremo C-terminal se extiende hacia el sitio activo (Klemm et al., 2020). Al igual que el SARS-CoV, también se encontró que el SARS-CoV-2 PL pro tiene un segundo sitio de unión de ubiquitina (SUb2) que es importante para la unión de poliubiquitina (K48-diubiquitina) e ISG15 (Klemm et al., 2020). El MERS-CoV (grupo espacial P6522) El complejo PL pro -ubiquitina fue resuelto por Bailey-Elkin et al. y en su artículo, se refieren a esta estructura como la conformación cerrada ya que el dominio de los dedos se desplaza hacia la ubiquitina (Bailey-Elkin et al., 2014).

Cuando la ubiquitina estaba presente en las estructuras pro del SARS-CoV-2, SARS-CoV y MERS-CoV PL, los resultados de Schr & # x000F6dinger y el acoplamiento ciego mostraron que los compuestos se desplazaron del bolsillo de unión del inhibidor de naftaleno (Figuras 3, 4 y Figuras complementarias 1, 2). En comparación con la apo PL pro, la hipericina no pudo producir poses de acoplamiento molecular para los complejos PL pro -ubiquitina. Asimismo, los resultados del acoplamiento proteína-proteína con los ligandos ya unidos a esta región en PL pro revelaron que la ubiquitina se unía en diferentes conformaciones y que la posición del extremo C-terminal estaba alterada (Figura 5). Esto sugiere que los compuestos dietéticos pueden interferir con la actividad deubiquitinasa de PL pro y en términos de en silico métodos, esto se puede evaluar más a fondo utilizando simulaciones de dinámica molecular (MD).

Se usó un ensayo PL pro enzimático disponible comercialmente para medir la actividad deubiquitinasa usando GRL-0617 como control positivo interno en este ensayo específico GRL-0617 ha demostrado tener un IC50 valor de 1,7 & # x003BCM para la inhibición de la actividad PL pro deubiquitinasa (BP Bioscience). En general, nuestros hallazgos indicaron inhibición con un orden de potencia de GRL-0617 e hipericina & # x0003E rutina y cianidin-3-O-glucósido & # x0003E galato de epigalocatequina y galato de epicatequina & # x0003E & # x0003E cefotaxima. GRL-0617 e hipericina & # x0003E rutina & # x0003E cianidin-3-O-glucósido y galato de epicatequina & # x0003E cefotaxima y galato de epigalocatequina (Figura 6). La potente inhibición de la actividad de PL pro deubiquitinasa por hipericina que, en concentraciones más altas, era análoga a GRL-0617, es particularmente alentadora. La hipericina es un derivado de la antraquinona que se puede encontrar en la planta con flores. Hypericum perforatum, que también se conoce comúnmente como St. John & # x00027s Wort (Napoli et al., 2018). Se ha identificado como un compuesto principal para la proteína de pico SARS-CoV-2 y sus propiedades antivirales han sido objeto de numerosos artículos en el pasado (Jacobson et al., 2001 Shih et al., 2018 Chen et al., 2019 ). Además de sus efectos antivirales, St. John & # x00027s Wort también se está investigando por sus propiedades antidepresivas y la hipericina sintética (SGX301) ha ganado atención por su uso como agente fotodinámico en el tratamiento del linfoma cutáneo de células T (Rook et al. ., 2010 Montoya et al., 2015 Apaydin et al., 2016).

Si bien se seleccionaron compuestos específicos para su uso en este estudio, sería importante expandir esto en el futuro para incorporar una mayor cantidad de fitoquímicos que están presentes en varios extractos de plantas. La farmacología en red también se utiliza cada vez más en el descubrimiento de fármacos y este enfoque sistemático puede ayudar a identificar posibles dianas proteicas y compuestos principales, así como a comprender sus mecanismos de acción (Zhang et al., 2019 Pan H. D. et al., 2020). No obstante, las propiedades antivirales, antioxidantes y antiinflamatorias de los compuestos utilizados en este estudio se habían informado previamente en la literatura y, en consecuencia, eran candidatos adecuados. El acoplamiento molecular se utilizó para el cribado virtual y, aunque las funciones de puntuación producidas a partir del acoplamiento no son energías de unión absolutas, permitió realizar predicciones sobre las interacciones proteína-ligando. El acoplamiento se realizó utilizando el protocolo Glide (XP) de Schr & # x000F6dinger Suite y en un estudio realizado por Wang et al., Se encontró que tenía una tasa de éxito del 90% en la identificación de las posturas de unión correctas de los ligandos (Wang et al. , 2016). En este estudio, las actividades inhibidoras de los compuestos se midieron posteriormente usando un ensayo de actividad enzimática. En silico Actualmente se utilizan herramientas para las primeras etapas del proceso de descubrimiento de fármacos; sin embargo, es importante tener en cuenta que el proceso implica varios pasos y es un proceso que requiere mucho tiempo (Agostino et al., 2019). Los fármacos potenciales deben explorarse más en los ensayos preclínicos utilizando una combinación de técnicas y ensayos clínicos (Agostino et al., 2019).


Abstracto

De una gran biblioteca combinatoria de péptidos bicíclicos químicamente restringidos, aislamos un selectivo y potente (KI = 53 nM) inhibidor del activador de plasminógeno de tipo uroquinasa humana (uPA) y cristalizó el complejo.Esto reveló una estructura extendida del péptido con ambos bucles peptídicos que se acoplan al objetivo para formar una gran superficie de interacción de 701 Å 2 con múltiples enlaces de hidrógeno e interacciones de carga complementarias, lo que explica la alta afinidad y especificidad del inhibidor. La interfaz se asemeja a la que existe entre dos proteínas y sugiere que estos péptidos restringidos tienen el potencial de actuar como pequeños imitadores de proteínas.


Papel de los sistemas ubiquitina-proteasoma en la biología y virulencia de los parásitos protozoarios

En las células eucariotas, los proteasomas desempeñan funciones cruciales en muchas vías celulares al degradar proteínas para hacer cumplir el control de calidad y regular muchos procesos celulares como la progresión del ciclo celular, la transducción de señales, la muerte celular, las respuestas inmunitarias, el metabolismo, el control de la calidad de las proteínas y el desarrollo. El corazón catalítico de estos complejos, el proteasoma 20S, está altamente conservado en bacterias, levaduras y seres humanos. Sin embargo, hasta hace unos años, el papel de los proteasomas en la biología del parásito era completamente desconocido. Aquí, resumimos los hallazgos sobre el papel de los proteasomas en la biología y virulencia de los parásitos protozoarios. Varios informes han confirmado el papel de los proteasomas en los procesos biológicos de los parásitos, como la diferenciación celular, el ciclo celular, la proliferación y la enquistación. La proliferación y la diferenciación celular son pasos clave en la colonización del hospedador. Considerando la importancia de los proteasomas en ambos procesos en muchos parásitos diferentes como Trypanosoma, Leishmania, Toxoplasma, y Entamoeba, los proteasomas del parásito podrían servir como factores de virulencia. Varias evidencias sugieren fuertemente que la vía ubiquitina-proteasoma es también una diana terapéutica parasitaria viable. Las investigaciones realizadas en los últimos años han demostrado que el proteasoma es un fármaco objetivo válido para la enfermedad del sueño y la malaria. Entonces, los proteasomas son un orgánulo clave en la biología y virulencia del parásito y parecen ser una nueva diana quimioterapéutica atractiva.

1. Introducción

En un artículo publicado en 1978, Ciehanover et al. [1] informó de la presencia de un componente polipeptídico termoestable de un sistema proteolítico dependiente de ATP aislado de reticulocitos. Un segundo artículo de los mismos investigadores informó que la conjugación dependiente de ATP de proteínas de reticulocitos con el polipéptido era necesaria para la degradación de proteínas [2]. Con base en estos hallazgos, Hershko et al. [3] propuso en 1980 que la ligadura de ubiquitina a proteínas se dirige a ellas para su degradación por una proteasa que actúa específicamente sobre proteínas con varias moléculas de ubiquitina unidas [3, 4]. Hough et al., Descubrieron una “proteasa”, el proteasoma 26S, que informaron de la identificación y caracterización de una proteasa dependiente de ATP a partir de lisados ​​de reticulocitos de conejo [5]. El impacto real de este descubrimiento se dimensionaría en las próximas décadas. De hecho, el trabajo de Hershko sobre las enzimas ubiquitina no solo fue relevante sino que contribuyó a abrir un nuevo campo de investigación que era oscuro e inexplorado en ese momento. El premio Nobel de Química de 2004, otorgado a Hershko, Ciechanover y Rose "por el descubrimiento de la degradación de proteínas mediada por ubiquitina", no solo fue un reconocimiento de estos investigadores, sino un reconocimiento de la importancia de la vía ubiquitina-proteasoma para la vida. de la célula ya la salud, la enfermedad, la infección y la inmunidad [6]. Muchos investigadores han contribuido a nuestro conocimiento actual de esta vía biológica. Ya se han publicado muchas revisiones relevantes. En este contexto, el objetivo principal de esta revisión es llamar la atención sobre un nuevo papel de los proteasomas: la biología y la virulencia de los parásitos protozoarios. Sólo se resumirán los aspectos generales de las rutas e inhibidores de ubiquitina-proteasoma.

2. El sistema ubiquitina-proteasoma

La mayor parte del recambio de las proteínas intracelulares en las células eucariotas se lleva a cabo mediante dos sistemas proteolíticos autónomos, los lisosomas y los proteasomas. La mayoría de las proteínas son degradadas por el sistema de ubiquitina-proteasoma (UPS) [6].

Los proteasomas son grandes complejos que desempeñan funciones cruciales en muchas vías celulares al degradar proteínas en el citosol y el núcleo de las células eucariotas para reforzar el control de calidad y regular muchos procesos celulares básicos. Entre estos procesos se encuentran la progresión a través del ciclo celular, la transducción de señales, la muerte celular, las respuestas inmunitarias, el metabolismo, el control de la calidad de las proteínas y el desarrollo, en los que los proteasomas degradan las proteínas reguladoras o estructuralmente aberrantes de corta duración [6, 7]. El corazón catalítico de estos complejos, el proteasoma 20S, está altamente conservado en bacterias, levaduras y humanos [8], con versiones más simples que también se encuentran en algunos Arqueas y procariotas.

El proteasoma 20S es un conjunto en forma de barril de 28 subunidades de proteínas. Forma una partícula empaquetada, resultado del apilamiento axial de dos α anillos y dos interiores β anillos formados por siete relacionados estructuralmente α y β subunidades los anillos forman una α1–7β1–7β1–7α1–7 estructura. Las tres subunidades de cada anillo interno contienen residuos de treonina catalíticamente activos en sus extremos N y muestran actividad nucleófila hidrolasa N-terminal, lo que indica que el proteasoma es una treonina proteasa [8]. los β1, β2, y β5 se asocian con actividades de tipo caspasa, de tipo tripsina y de tipo quimotripsina, respectivamente, que confieren la capacidad de escindir enlaces peptídicos en el lado C-terminal de los residuos de aminoácidos ácidos, básicos e hidrófobos, respectivamente. Los enlaces que siguen a la glicina y la prolina se rompen con menos facilidad [9]. Como revelaron los estudios estructurales realizados por Huber y colegas [10, 11], la eliminación potencialmente catastrófica de sustratos inapropiados se evita mediante el secuestro de sitios activos dentro de la estructura hueca del proteasoma 20S. Los sustratos acceden a la cámara catalítica central a través de puertos axiales en los anillos finales de α subunidades [12], aunque en ausencia de activadores, estos canales se cierran y se reprime la actividad del proteasoma. El proteasoma 20S degrada procesivamente las proteínas del cliente, generando oligopéptidos con una longitud de entre 3 y 15 aminoácidos. Los productos peptídicos resultantes se hidrolizan posteriormente a aminoácidos mediante oligopeptidasas y / o amino-carboxipeptidasas [9].

Los proteasomas son activados por complejos de proteínas que se unen a los anillos terminales de α subunidades. El activador más conocido es PA700 [activador del proteasoma MW 700, también conocido como 19S o complejo regulador (RC)], que se ha conservado en gran medida desde la levadura hasta los seres humanos y se une al proteasoma 20S para formar el proteasoma 26S. PA700 es el único activador del proteasoma, es decir, conocido por estimular la degradación de sustratos proteicos. Por lo tanto, se cree que PA700 media la mayoría de los efectos biológicos del proteasoma al facilitar la degradación del sustrato [13, 14]. En contraste con PA700, otros dos complejos de proteínas conservadas evolutivamente que se ha demostrado que se unen específicamente y activan proteasomas 20S contra sustratos de péptidos modelo, PA28 (también conocido como 11S o REG) [7, 15] y PA200 [7, 16], no reconocen proteínas ubiquitinadas ni utilizan ATP. El activador de proteasoma PA200 mejora la escisión mediada por proteasoma después de residuos ácidos in vitro sin embargo, en respuesta a la radiación ionizante, PA200 forma proteasomas híbridos con tapas 19S y proteasomas centrales 20S que se acumulan en la cromatina, lo que lleva a un aumento de la actividad proteolítica. Se ha informado de un papel único de PA200 en la estabilidad genómica, es decir, probablemente mediado por su capacidad para mejorar la escisión post-glutamilo por proteasomas [17]. Blm10 / PA200 (Saccharomyces cerevisiae/ humano) no utiliza ATP y generalmente se cree que estimula la hidrólisis de péptidos pero no de proteínas. Se ha propuesto que Blm10 / PA200 funciona en una variedad sorprendentemente amplia de procesos [18], incluido el ensamblaje del proteasoma 20S [19], la reparación del ADN [20], la estabilidad genómica [17], la inhibición del proteasoma [21], la espermatogénesis [22], y regulación de los puntos de control mitocondriales [23]. Sin embargo, también se han descrito inhibidores endógenos como Hsp 90, P131, PR 39 y Tat. El papel biológico de los proteasomas 26S y sus activadores e inhibidores se ha revisado ampliamente en otros lugares [5, 7, 24, 25]. Han surgido nuevos mecanismos reguladores. El complejo ARchaeal PAN ATPasa es homólogo a las 19S ATPasas eucariotas y contiene un motivo C-terminal hidrofóbico-tirosina-X conservado (HbYX), es decir, esencial para que PAN se asocie con los proteasomas 20S y abra su canal cerrado para la entrada del sustrato [ 26]. La apertura de la puerta puede ser inducida por péptidos C-terminales de las subunidades de ATPasa 19S, Rpt2 y Rpt5, pero no por péptidos C-terminales de PA28 / 26, que carecen del motivo HbYX y provocan la apertura de la puerta por distintos mecanismos. También se demostró que los residuos C-terminales en las ATPasas 19S son críticos para la activación y la estabilidad de los proteasomas 26S. Por lo tanto, los extremos C de las ATPasas proteasómicas funcionan como una "llave en una cerradura" para inducir la apertura de la puerta y permitir la entrada del sustrato [26]. Recientemente, se ha demostrado que la unión de sustratos poliUb al regulador 19S estabiliza la apertura de la puerta del proteasoma 20S e induce cambios conformacionales en el proteasoma 20S que facilitan la canalización de sustratos y su acceso a sitios activos. En consecuencia, los sustratos de poliUb estimulan alostéricamente su propia degradación, aumentando las actividades de la peptidasa del proteasoma 20S aproximadamente al doble en un proceso que requiere hidrólisis de ATP [27]. Además, un conjunto de pruebas publicado recientemente sugiere que muchas funciones del proteasoma, como el reconocimiento de sustratos, la desubiquitilación, el desdoblamiento y la degradación, parecen estar controladas alostéricamente [28, 29].

En esta vía, las proteínas se dirigen a la degradación mediante ligadura covalente con ubiquitina. La ubiquitinación marca la proteína diana con proteínas similares a la ubiquitina (UBL), como la ubiquitina, el modificador pequeño similar a la ubiquitina (SUMO) y NEDD8. La ubiquitinación es una modificación postraduccional de proteínas en la que el modificador es un polipéptido conjugado con las proteínas diana mediante un enlace isopéptido entre los sustratos del proteasoma: el terminal C de la ubiquitina y una o más cadenas laterales de lisina en las proteínas diana [30]. La modificación de proteínas por ubiquitina se produce en tres pasos sucesivos mediados por tres enzimas: la enzima activadora E1, la enzima conjugadora E2 y la ubiquitina ligasa E3. Esta modificación es reversible, y las proteínas ubiquitinadas pueden desubiquitinarse proteolíticamente mediante enzimas desubiquitinantes específicas [30, 31]. Las moléculas de ubiquitina pueden formar cadenas de poliubiquitina que se conjugan con proteínas diana, que generalmente son reconocidas y degradadas por el proteasoma [30, 32] sin embargo, el conocimiento actual de UPS sugiere fuertemente que la ubiquitinación de proteínas parece ser necesaria pero no esencial. Un artículo reciente informa que los proteasomas pueden degradar una proporción significativa de proteínas celulares independientemente de la ubiquitinación. Luego, los proteasomas 26S reconocen y escinden específicamente sitios similares, independientemente de la ubiquitinación, lo que sugiere que las regiones desordenadas probablemente constituyen la señal estructural universal para la proteólisis del sustrato del proteasoma por parte de los proteasomas. De la misma manera, la inactivación de la enzima activadora de ubiquitina E1 no previene la degradación intrínseca de los sustratos del proteasoma [33].

El cuadro se completa con las enzimas desubiquitinantes (DUB) [30, 34]. Generan restos Ub libres a partir de sus productos de traducción iniciales, reciclan la ubiquitina durante la descomposición de los conjugados poliubiquitina-proteína y / o revierten los efectos de la ubiquitinación. Todos los DUB probados tienen una especificidad notable para la ubiquitina. Los DUB se han implicado en una variedad de procesos en animales y levaduras, lo que sugiere que los DUB individuales son específicos del objetivo [34]. Una posibilidad intrigante es que algunos DUB también pueden regular la vida media de una proteína al revertir la ubiquitinación. Un gran número de genes codifican enzimas desubiquitinantes, lo que sugiere que muchos tienen funciones reguladas y muy específicas. Curiosamente, muchas de estas enzimas están localizadas en estructuras subcelulares o en complejos moleculares. Estas localizaciones juegan un papel importante en la determinación de la especificidad funcional y pueden tener una gran influencia en sus actividades catalíticas [34]. De hecho, hallazgos recientes sugieren fuertemente que la ubiquitinación está regulada por vías específicas de ubiquitinación y desubiquitinación. En resumen, los sustratos proteicos se conjugan primero con múltiples moléculas de ubiquitina y luego los sustratos de ubiquitina se hidrolizan rápidamente por el proteasoma 26S, un complejo dependiente de ATP que comprende el proteasoma 20S central encerrado por dos complejos reguladores del activador del proteasoma (19S). Las enzimas de desubiquitinación reciclan las moléculas de ubiquitina y la vía es modulada por activadores e inhibidores de proteínas. En la Figura 1 se muestra una descripción general del sistema ubiquitina-proteasoma.

En resumen, la vía ubiquitina-proteasoma no es solo una máquina de degradación enfocada a destruir proteínas viejas o dañadas. Esta vía es un punto de control importante para regular, entre otras cosas, las proteínas de vida corta que funcionan como factores reguladores en una gran variedad de procesos celulares como la progresión del ciclo celular [35], el crecimiento celular, la transcripción de genes específicos por etapas [36], respuesta inflamatoria [37] y procesamiento de antígenos [32]. Los proteasomas eucariotas 20S tienen varias actividades de peptidasa, así como actividades de endoribonucleasa, proteína-chaperona y ADN-helicasa [38].

Hasta hace unos años, el papel de los proteasomas en la biología del parásito era completamente desconocido.

3. El papel de los proteasomas en la biología y virulencia de los parásitos

Los protozoos parásitos son células unicelulares pero complejas que se someten a múltiples eventos de diferenciación para adaptarse a los diversos hospedadores y entornos físicos que encuentran en sus ciclos de vida.

Algunas proteasas participan en la diferenciación de las etapas infecciosas de un pequeño número de parásitos protozoarios en sus respectivas etapas causantes de la enfermedad [39-41]. El papel central que desempeñan las actividades proteolíticas del sistema proteasoma / ubiquitina en la regulación de la homeostasis celular se ha demostrado en un gran número de hongos y eucariotas superiores y, más recientemente, en parásitos protozoarios [42].

Una característica destacada del ciclo de vida de los parásitos patógenos son los profundos cambios morfológicos que experimentan durante el desarrollo en los huéspedes vertebrados e invertebrados. Estos cambios en el desarrollo, durante los cuales la forma, el tamaño y las estructuras citoesqueléticas deben adaptarse a la nueva etapa, implican una proteólisis extensa y cuidadosamente controlada. La intrigante pregunta de qué sistema proteolítico está involucrado en la degradación de proteínas en los parásitos nos llevó a investigar el papel de los proteasomas en la diferenciación de los parásitos protozoarios.

Los proteasomas 20S de los parásitos protozoarios son similares en morfología y tamaño al proteasoma 20S aislado de arqueobacterias, levaduras y mamíferos. De manera similar, la composición de las subunidades de proteasomas de protozoos es muy similar a la de los proteasomas eucariotas, con múltiples α y β subunidades en lugar del tipo único de α y β subunidad descrita en Proteasomas de arqueobacterias. Estudios en diferentes laboratorios y con diferentes modelos han encontrado que la inhibición de la función proteasomal inhibe etapas específicas de diferenciación morfológica en Tripanosoma, Plasmodium, y Entamoeba y replicación de Plasmodium, Toxoplasma, Leishmania, y Tripanosoma sin embargo, la invasión de la célula huésped no se inhibe en Tripanosoma, Plasmodium, Leishmania, o Toxoplasma. Se han observado diferencias entre los proteasomas de mamíferos y parásitos (Tripanosoma), ya que tienen diferencias en las estructuras inmunorreactivas (Tripanosoma y Toxoplasma) y actividades enzimáticas (Tripanosoma y Entamoeba). Estas diferencias sugieren que los proteasomas del parásito protozoario podrían considerarse como una diana quimioterapéutica, aunque este orgánulo también está presente en todas las células eucariotas del huésped. En las células de los mamíferos, el sistema del proteasoma de ubiquitina es esencial para todas las células eucariotas. Cualquier alteración de sus componentes tiene, por tanto, posibles consecuencias patológicas [43]. La quimioterapia dirigida a los proteasomas del parásito podría resultar en terapias exitosas.

Los siguientes son los principales hallazgos reportados en la literatura con respecto al papel de los proteasomas del parásito protozoario.

3.1. Cryptosporidium

Una secuencia de ADN compuesta por 1281 nucleótidos (nt) que consta de un único marco de lectura abierto (ORF) que codifica un presunto proteasoma 20S βLa subunidad de tipo 1 se aisló de Cryptosporidium parvum. El análisis de transferencia Southern sugirió que el ADN secuenciado existe en el C. parvum genoma como una sola copia. La proteína predicha consta de 210 aminoácidos (aa), incluidos los aminoácidos característicos comunes a todas las subunidades proteasómicas, y es más similar a la subunidad de levadura de tipo beta1 que a otros tipos de subunidades beta [44]. Ningún estudio ha examinado su papel biológico.

3.2. Giardia

El parásito tiene un solo gen que codifica la monoubiquitina; sin embargo, los ensayos de electroforesis bidimensional han demostrado que el Giardia El proteasoma 20S parece ser tan complejo como el de otros eucariotas [45]. Un estudio de los siete genes que codifican la α subunidades del G. duodenalis proteasoma indicó que el α-familia de genes del proteasoma evolucionó rápidamente de un solo gen en Archaea a siete o más genes en Eukarya [46]. los G. duodenalis El proteasoma 20S parece ser similar al descrito en células eucariotas, que contiene un conjunto divergente de α subunidades [47]. Los enfoques de proteómica realizados para descubrir proteínas nuevas asociadas con las vesículas específicas de enquistación (ESV) de tipo Golgi, específicas de la etapa, identificaron factores citoplasmáticos y luminales del sistema de control de calidad del retículo endoplásmico, es decir, varios (α) y catalítico (β) subunidades del proteasoma. Por el contrario, los complejos de proteasoma citoplasmático se someten a una relocalización regulada por el desarrollo a las ESV durante la enquistación. En las células de mamíferos y en la levadura, los complejos de proteasoma se localizan en las membranas del RE además del citoplasma y el nucleoplasma. El análisis de microscopía confocal demostró que el complejo del núcleo giardial 20S y la estructura de la tapa 19S se asociaron con las membranas de ESV durante la enquistación temprana hasta al menos 7 h después de la inducción. Como se señaló anteriormente, la expresión de las subunidades del proteasoma no se regula al alza en las células enquistadas [47]. Los datos de microscopía confocal indicaron una relocalización de sitios más periféricos en el citoplasma a la vecindad de ESV, lo que indica una alta tasa de retrotranslocación de proteínas orgánulos destinadas a la degradación. A la luz de estos resultados, los autores propusieron que el reclutamiento de proteasomas durante la enquistación es una consecuencia del control de calidad y los procesos de maduración de la carga en el RE y las ESV tempranas (es decir, plegamiento de proteínas, heterooligomerización y recorte) que producen grandes cantidades de material destinado a la degradación [ 48].

3.3. Entamoeba

La actividad 20S en los proteasomas se describió basándose en el patrón electroforético SDS y el análisis de inmunotransferencia de un Entamoeba histolytica extracto fraccionado por centrifugación en gradiente de densidad [49]. Un estudio de la E. histolytica proteoma confirmó la presencia de componentes ubiquitina-proteasoma [50]. Por otro lado, los genes que codifican la α Las subunidades del proteasoma muestran una mayor identidad con los proteasomas de mamíferos (60,1% de homología con proteasomas de rata y 60,5% con proteasomas humanos) que con proteasomas de Thermoplasma acidophilum y Saccharomyces cerevisiae (39,5% y 53,8%, respectivamente).En E. histolytica trofozoítos, la localización nuclear del complejo 20S no fue evidente ni siquiera mediante microscopía confocal de alta resolución [51]. En cambio, la reactividad fluorescente contra las subunidades del proteasoma EhotS y EhS2 se observó exclusivamente en el citosol, exhibiendo una distribución homogénea sin exclusión aparente de compartimentos que se asemejan al aparato ER y Golgi, como se observa en otros tipos de células [30, 51].

Recientemente, múltiples E. histolytica Se han clonado y caracterizado los componentes de ubiquitinación, incluida la ubiquitina y sus enzimas activadora (E1), conjugadora (E2) y ligadora (E3). EhUbiquitin se activa y forma un enlace tioéster con EhUba1 (E1) in vitro de forma dependiente de ATP y magnesio. Según los autores, EhUba1 exhibe una mayor velocidad inicial máxima de intercambio pirofosfato-ATP que su homólogo humano, lo que sugiere que podrían existir diferentes cinéticas de activación de ubiquitina en E. histolytica [52].

En una ameba reptil, Entamoeba invadens, la encisión es inhibida por la lactacistina, un inhibidor específico e irreversible de los proteasomas [53], sin embargo, la lactacistina no parece tener efecto sobre E. invadens excystation [54].

3.4. Leishmania

Estos parásitos son parásitos protozoarios con una etapa intracelular llamada amastigote que se replica en macrófagos de mamíferos y una etapa extracelular llamada promastigote que se replica en el intestino del insecto hematófago perteneciente al género Lutzomyia.

Proteasomas purificados de L. mexicana se estudiaron mediante electroforesis en gel de poliacrilamida (SDS-PAGE), revelando 10 bandas diferentes con masas que oscilan entre 22 y 32 kDa, lo que sugiere una complejidad similar a la de los proteasomas eucariotas [55]. Lactacistina afectada L. mexicana replicación solo cuando se usa en concentraciones superiores a 5 μm, mientras que MG132 bloqueó el mismo proceso a concentraciones más bajas. Estas discrepancias pueden deberse a la menor capacidad de L. mexicana para incorporar estos inhibidores. Según Christensen et al. [56], un nuevo antígeno que se asemeja a un α subunidad del proteasoma 20S humano se identificó en Leishmania. Este antígeno (LePa) es inmunogénico en humanos. Además, una vacuna de ADN basada en el antígeno LePa indujo una reducción inicial en el tamaño de las lesiones cuando los ratones fueron desafiados con Leishmania mayor. La fuerte inmunogenicidad del Leishmania proteasoma fue confirmado por Couvreur et al. [57], quien informó que el antígeno 24, un complejo inmunogénico aislado de Leishmania infantum utilizado como antígeno de referencia en el inmunodiagnóstico de la leishmaniasis visceral humana, fue reconocido por el suero de conejos inmunizados con purificado L. mexicana proteasomas. Por otro lado, el Leishmania chagasi El proteasoma estaba parcialmente purificado y mostró sensibilidad a la lactacistina y a la clasto-lactacistina beta-lactona, que bloquearon la in vitro crecimiento de la etapa de promastigote. Aunque el pretratamiento de los promastigotes con lactacistina no inhibió la invasión celular, la función proteasomal parece ser esencial para la replicación y la supervivencia intracelular de los amastigotes en la célula huésped [58].

En sincronizado Leishmania culturas, Dubessay et al. [59] informó de la regulación dependiente del ciclo celular de los niveles de proteínas. Una cinesina llamada LmjKIN13-1 es muy abundante en la fase G2 + M y está presente en niveles muy bajos después de la mitosis. Esta proteína se degrada a través de las rutas de ubiquitina-proteasoma, lo que demuestra que tiene señales de degradación redundantes C-terminales. Esta observación sugiere que en Leishmania, en el que la regulación postranduccional es rara o ausente, el proteasoma parece estar involucrado en la regulación de los niveles de proteínas [59]. Por otro lado, en Leishmania donovani, Se ha informado de la degradación de la pteridina reductasa 1 (PTR1). En Leishmania, PTR1 es una enzima esencial en el metabolismo de la pterina y el folato. Estudios de Western blot utilizando L. donovani los promastigotes transfectados con PTR1-GFP mostraron que PTR1 se degradaba en la fase estacionaria de crecimiento, cuando los parásitos inician la metaciclogénesis. De manera similar, se identificó una caja de destrucción probable compuesta por nueve aminoácidos (Q63ADLSNVAK71) y un residuo de lisina K156 (como un sitio de conjugación de ubiquitina) en L. donovani PTR1. Este hallazgo sugiere que la degradación de PTR1 durante la fase estacionaria de crecimiento está mediada por proteasomas, lo que da como resultado niveles bajos de H4-biopterina, que promueve la metaciclogénesis y, posteriormente, da como resultado etapas de parásito altamente infecciosas [60]. Se ha demostrado que dos inhibidores de la proteasa del VIH, indinavir y saquinavir, bloquean las funciones del proteasoma. Se observaron efectos sobre el crecimiento de L. major y Leishmania infantum. Después de 24 h de tratamiento, ambos fármacos presentaron actividad antileishmanial dosis-dependiente, con valores de dosis letales del 50% (DL50), 8,3 μM y 7 μLun L. majory actividad menor en L. infantum. Estos resultados sugieren el uso potencial de estos inhibidores de proteasa contra infecciones oportunistas en pacientes tratados con seropositividad [61].

También se ha informado en L. donovani que el proteasoma está involucrado en la regulación a la baja de la metionina adenosiltransferasa (MAT), una enzima importante para los procesos metabólicos, su producto, S-adenosilmetionina (AdoMet), juega un papel clave en la transmetilación, trans-sulfuración y síntesis de poliaminas. La presencia de inhibidores del proteasoma como MG-132, MG-115, epoxomicina y lactacistina en el medio de cultivo evitó la degradación de MAT en cepas de leishmanias que sobreexpresan MAT y cepas de leishmanias "simuladas de transfección". El papel de la vía de la ubiquitina (Ub) en la regulación negativa de MAT también fue respaldado por experimentos de inmunoprecipitación. El MAT inmunoprecipitado reaccionó de forma cruzada con anticuerpos anti-Ub, proporcionando evidencia de una regulación a la baja mediada por proteasomas de la abundancia de MAT leishmanial [62].

3.5. Tripanosomas

los Tripanosoma el proteasoma es el más intensamente estudiado de los proteasomas del parásito. El proteasoma de Trypanosoma brucei fue el primero en ser purificado y caracterizado, sin embargo, no se describió su papel en la biología del parásito [63]. El trabajo posterior mostró que la actividad del proteasoma parece ser esencial para la progresión del ciclo celular, aunque la participación parece diferir entre la sangre y las formas procíclicas. La cantidad de lactacistina necesaria para inhibir la proliferación de concentraciones de formas procíclicas fue de 5 a 10 μm, cinco veces mayor de lo necesario para inhibir el mismo proceso en las formas sanguíneas. Según los autores, esta diferencia de sensibilidad a los inhibidores podría explicarse por diferencias en la permeabilidad celular. El análisis de ADN por citometría de flujo mostró que en las formas procíclicas, la lactacistina inhibe la progresión del ciclo celular en las fases G2 y M, mientras que en las formas sanguíneas lo hace en las fases G1 / S, G2 y M. Según los mismos autores, en T. brucei, lactacistina en 1 μM fue incapaz de bloquear la diferenciación de las formas sanguíneas al estadio procíclico [64]. Estos resultados sugieren que en los tripanosomas, los proteasomas participan en la regulación de los niveles de ciclina [65]. El proteasoma 20S purificado a partir de formas procíclicas y del torrente sanguíneo tiene una actividad similar a la tripsina aumentada, a diferencia de los proteasomas eucarióticos en los que la actividad similar a la quimotripsina es mayor. Además, otras diferencias entre T. brucei y se han encontrado proteasomas de mamíferos. (1) El proteasoma 20S de los tripanosomas tiene un peso molecular de 630 kDa, mientras que el de los mamíferos es de 700 kDa (2) los geles 2D del proteasoma tripanosoma 20S tienen solo 26 manchas de proteína, menos que las observadas en los proteasomas 20S aislados de ratas hígados [66] (3) aunque la morfología y el tamaño del T. brucei proteasoma son similares a los descritos en los proteasomas de mamíferos, el diámetro de los poros del T. brucei El proteasoma 20S es mayor que el observado en la rata. Los anticuerpos policlonales del proteasoma 20S (4) producidos contra el proteasoma 20S humano reaccionaron de forma cruzada con las formas procíclica y del torrente sanguíneo de T. brucei Proteasoma 20S, sin embargo, reconocieron fuertemente el proteasoma 20S de rata. Por otro lado, los anticuerpos policlonales obtenidos contra el proteasoma 20S purificado aislado de formas sanguíneas de T. brucei 20S también reaccionó con el proteasoma 20S purificado aislado de formas procíclicas del parásito pero no con el proteasoma 20S de eritrocitos de rata. los α5 subunidad de T. brucei el proteasoma tiene sólo un 50% de identidad de secuencia con la del proteasoma de rata [67].

También se identificó un activador del proteasoma 20S en formas procíclicas y sanguíneas de T. brucei. In vitro, el PA26 de 26 kDa se polimeriza espontáneamente con el proteasoma 20S para generar el proteasoma 20S activado [68]. Su contraparte humana, PA28α, fue tan eficaz como PA26 para asociarse y estimular la actividad enzimática del proteasoma 20S de rata, pero no pudo activar el proteasoma 20S de T. brucei. Además, a diferencia de los proteasomas de mamíferos y levaduras, el T. brucei El proteasoma no puede degradar el complejo ornitina descarboxilasa-antizima (ODC) de mamíferos, que cataliza el primer paso en la biosíntesis de poliaminas. Esta incapacidad es una diferencia significativa entre los tripanosomas y los proteasomas de mamíferos [69]. Además, la caracterización funcional de 11 subunidades no ATPasa (partículas reguladoras no ATPasa (Rpn)) en el complejo regulador 19S mostró que cuando Rpn10 era deficiente, se formó un complejo sin Rpn, pero se detuvo el crecimiento celular. Esta prescindibilidad estructural pero indispensable funcional de Rpn10 constituye otro aspecto único de la T. brucei proteasoma [70]. De manera similar, los enfoques proteómicos y bioinformáticos han permitido la identificación y mapeo de T. brucei proteasomas [71].

Se han probado nueve tripéptidos de éster de vinilo selectivos para la inhibición de la actividad similar a la tripsina del proteasoma de mamíferos. in vitro actividad contra T. brucei. Dos mostraron actividad tripanocida en el rango micromolar bajo sin mostrar citotoxicidad contra las células humanas; sin embargo, los compuestos no inhibieron la actividad similar a la tripsina del proteasoma del tripanosoma, aunque su efecto se correlaciona con la inactivación de la actividad similar a la quimotripsina. Este hallazgo sugiere que las sensibilidades a los inhibidores difieren entre el proteasoma de mamíferos y el tripanosoma. Esta diferencia puede aprovecharse para el desarrollo racional de fármacos antitripanosomales [72].

Por otro lado, el papel del T. cruzi proteasomas en la diferenciación tripomastigote-amastigote se ha documentado claramente [73, 74]. La lactacistina bloqueó significativamente la transformación de tripomastigotes en amastigotes en medio axénico a pH 5,0 [73]. El proteasoma 20S se purificó y caracterizó y se demostró que posee actividades similares a tripsina, quimotripsina y caspasa. El tratamiento con lactacistina no bloquea la invasión celular, pero reduce considerablemente la descarga del parásito. De manera similar, el marcaje metabólico de leucina C 14 de tripomastigotes mostró que la proteólisis ocurre durante T. cruzi diferenciación celular de tripomastigote a amastigote. Esta vía proteolítica fue bloqueada por inhibidores del proteasoma como lactacistina y vinilsulfona, pero no por inhibidores de serina o cisteinil proteinasa, lo que sugiere que la degradación de proteínas que ocurre durante la diferenciación de las células del parásito depende del proteasoma [74]. Luego, durante la diferenciación de las células del parásito a pH ácido, se observó una vía proteolítica dependiente de ATP y se identificaron y caracterizaron los proteasomas 26S por primera vez en un parásito protozoario [74]. De manera similar, estos autores demostraron que las proteínas del citoesqueleto, especialmente el antígeno de la varilla paraflagelar, se degradaban por una vía dependiente del proteasoma. Sin embargo, los anticuerpos monoclonales producidos contra el T. cruzi El proteasoma 20S se ha observado mediante microscopía electrónica y estudios confocales, la presencia de proteasomas en el núcleo, citoplasma y cinetoplastos. Estos hallazgos se confirmaron mediante la detección de actividades similares a la quimotripsina del proteasoma en el cinetoplasto, aislado por gradientes de Percoll [75]. En células de mamíferos, el UPS se ha encontrado en las proteínas de control de calidad de la degradación asociada a la membrana mitocondrial externa (OMMAD) localizadas en el OMM [76]. Luego, en la membrana externa, el UPS puede desempeñar un papel en el reciclaje de proteínas importadas o incrustadas en la membrana [77]. El papel que cumplen los proteasomas en T. cruzi el cinetoplasto aún se desconoce. Sin embargo, podríamos especular que los proteasomas pueden estar involucrados no solo en el control de calidad de las proteínas sino también en los cambios morfológicos del cinetoplasto que ocurren cuando los tripomastigotes se diferencian en amastigotes o los epimastigotes se diferencian en tripomastigotes metacíclicos.

Según Cardoso et al. [78], inhibición de la vía ubiquitina-proteasoma en T. cruzi los epimastigotes no bloquean la adhesión, pero interrumpen la división celular. Del mismo modo, in vitro T. cruzi La metaciclogénesis fue fuertemente inhibida (95%) por el tratamiento con 5 μM de lactacistina.

Proteólisis proteasomal durante la in vitro metaciclogénesis de T. cruzi también se ha estudiado. Cardoso y col. [79] demostró que la proteólisis dependiente del proteasoma se produce durante la metaciclogénesis. No se observaron picos de degradación mediada por ubiquitina, y el perfil de conjugados ubiquitinados fue similar en todas las etapas de diferenciación; sin embargo, un análisis de proteínas carboniladas mostró una variación significativa en los niveles de proteína oxidada en las diversas etapas de diferenciación, y también la inhibición del proteasoma. aumento de los niveles de proteína oxidada. Estas observaciones sugieren que coexisten diferentes complejos de proteasomas durante la metaciclogénesis. El proteasoma 20S puede estar libre o ligado a partículas reguladoras (PA700, PA26 y PA200), en sitios celulares específicos, y la acción coordinada de estos complejos haría posible que la proteólisis de proteínas etiquetadas con ubiquitina y proteínas oxidadas co-ocurriera en el celda. Además, estos hallazgos sugieren fuertemente que la serie coordinada de adaptaciones bioquímicas que ocurren durante T. cruzi La metaciclogénesis también puede estar regulada por la actividad de diferentes complejos de proteasoma. Estos datos también destacan la importancia de la degradación proteasomal independiente de la ubiquitina durante la metaciclogénesis [79]. El papel de los proteasomas en la diferenciación celular nos llevó a proponer este orgánulo como factor de virulencia de los tripanosomas [80].

Dos genes que codifican el α1 y α6 subunidades del T. cruzi El proteasoma se ha clonado y caracterizado [81]. Teniendo en cuenta que la mayor parte de los estudios estructurales se han realizado en tripanosomas [67, 69, 74, 75], en la Tabla 1 se muestra una composición de subunidades de humanos, levaduras y tripanosomas.

3.6. Plasmodium

La presencia del Plasmodium El proteasoma se mostró por primera vez usando inhibidores. Lactacistina inhibe la in vitro desarrollo de formas exoeritrocíticas de Plasmodium berghei pero no inhibe la invasión de esporozoitos de la célula huésped. El efecto inhibidor de la lactacistina es específico de la etapa y, aunque ninguna rata infectada sobrevivió, la lactacistina redujo la parasitemia de los animales infectados. Por tanto, los autores sugirieron el proteasoma como un objetivo quimioterapéutico prometedor [82]. Por otro lado, la lactacistina inhibió el crecimiento de tres líneas diferentes de Plasmodium falciparum a concentraciones molares similares y fue más eficaz contra los parásitos resistentes a la cloroquina [83]. Los genes que codifican β subunidades de P. falciparum El proteasoma 20S ya ha sido clonado [84].

La fosfoetanolamina metiltransferasa (fepm), una enzima de importancia central en la vía de la serina descarboxilasa fosfoetanolamina metiltransferasa (SDPM), está regulada transcripcionalmente negativamente y degradada por el proteasoma en presencia de colina. Los experimentos de inmunotransferencia, persecución de pulsos e inmunoprecipitación de cromatina han demostrado que la degradación de Pfpmt se produjo no solo en células de tipo salvaje sino también en parásitos transgénicos que expresan Pfpmt de manera constitutiva. El inhibidor del proteasoma bortezomib bloqueó la degradación de Pfpmt mediada por colina. Estos datos fueron la primera evidencia de que un metabolito puede mediar la regulación transcripcional y la degradación del proteasoma en Plasmodium [85].

La gliotoxina (GTX), un metabolito de origen fúngico, puede tener in vitro efecto antipalúdico. GTX mostró actividad contra cepas de cepas sensibles y resistentes a la cloroquina. P. falciparum. La citotoxicidad de GTX fue significativamente menor frente a líneas de células hepáticas normales [86]. Según los mismos investigadores, GTX bloqueó la actividad similar a la quimotripsina en el P. falciparum proteasoma. De la misma manera, MLN-273, un inhibidor del proteasoma perteneciente a la familia del ácido peptidil borónico, ha demostrado inhibir las etapas intraeritrocíticas tempranas de P. falciparum, así como las etapas exoeritrocíticas de P. berghei. El inhibidor no afectó a los eritrocitos ni a las células del hígado, pero provocó una reducción significativa en la degradación de las proteínas del parásito. Según estos autores, el uso de inhibidores del proteasoma como fármacos antineoplásicos sugiere la posibilidad de una quimioterapia antipalúdica basada en inhibidores del proteasoma [87]. Desde esta perspectiva, los inhibidores del proteasoma como bortezomib (Velcade: [(1R) -3-metil-1 - [[(2S) -1-oxo-3-fenil-2 - [(pirazinilcarbonil) amino] propil] amino] butil] ácido borónico), que ha sido aprobado para el tratamiento de pacientes con mieloma, y ​​un boronato similar llamado Z-Leu-Leu-Leu-B (OH) 2 (ZL3B), se evaluaron frente a cuatro cepas de P. falciparum (3D7, HB3, W2 y Dd2) que tenían diferentes niveles de sensibilidad a los fármacos antipalúdicos como la pirimetamina y la cloroquina. Ambos fármacos fueron igualmente eficaces contra parásitos susceptibles y resistentes, bloqueando el desarrollo de parásitos intraeritrocíticos. Estos datos sugieren firmemente que estos fármacos podrían utilizarse solos o en asociación con la quimioterapia antipalúdica [88].

Un estudio completo de los inhibidores del proteasoma activos contra P. falciparum cepas de laboratorio y aislados de campo de Gabón mostraron que la epoxomicina era muy activa contra P. falciparum y no mostró signos de resistencia cruzada con fármacos similares o cualquier otro inhibidor del proteasoma en un área con alta resistencia a la cloroquina [89].

Aunque el Plasmodium Se ha sugerido el proteasoma como posible objetivo de un fármaco antipalúdico, la toxicidad de los inhibidores ha impedido la validación de esta enzima. en vivo. Se realizó un cribado de una biblioteca de 670 análogos del reciente inhibidor aprobado por la Administración de Drogas y Alimentos de los EE. UU., Carfilzomib, para identificar compuestos que matan selectivamente a los parásitos. Uno de ellos, PR3, mostró una importante actividad parasitaria in vitro pero redujo drásticamente la toxicidad en las células huésped. Según los autores, esta toxicidad específica del parásito no se debió a la orientación selectiva del Plasmodium proteasoma sobre el proteasoma del huésped, pero debido a la falta de actividad contra una de las subunidades del proteasoma humano. Posteriormente, utilizaron PR3 para reducir significativamente la carga de parásitos en P. berghei ratones infectados sin toxicidad del huésped, validando así el proteasoma como un objetivo viable de fármacos antipalúdicos [90].

3.7. Toxoplasma

los Toxoplasma gondii El proteasoma se ha examinado en términos de su localización intracelular y actividad enzimática. Los estudios de inmunofluorescencia con anticuerpos contra el proteasoma han demostrado que, a diferencia de las células eucariotas (en las que el proteasoma se encuentra tanto en el núcleo como en el citosol), en Toxoplasma, los proteasomas están restringidos al citosol. Se detectó actividad similar a la quimotripsina, con Km valores cercanos a los observados en células eucariotas [91]. El pretratamiento de taquizoítos libres con inhibidores del proteasoma (10 μm lactacistina) o 5 μLa m gliotoxina [92] no bloqueó la entrada del parásito o la formación de la vacuola parasitófora, pero bloqueó el crecimiento intracelular del parásito y la síntesis de ADN. Sin embargo, Shaw et al. [93] mostró que la lactacistina (2 μm) no bloqueó la entrada del parásito o el establecimiento de la vacuola parasitófora, pero inhibió el crecimiento del parásito y la gemación de las células hijas, así como la síntesis de ADN. El pretratamiento de las células huésped con lactacistina no bloqueó la entrada ni el desarrollo del parásito. Estos resultados destacan el posible papel de Toxoplasma actividad del proteasoma en el desarrollo intracelular y regulación de la replicación del parásito. De la misma manera, la penetración del parásito en las células hospedadoras no fue modificada por una alta concentración de gliotoxina (1 μm), pero la replicación se redujo notablemente (aproximadamente el 50% de inhibición por 0,5 μm gliotoxina). La gliotoxina redujo la actividad similar a la quimotripsina del Toxoplasma proteasoma con una potencia cinco veces menor que en las células HeLa [92]. Los principales hallazgos sobre el papel de los proteasomas en los parásitos protozoarios se resumen en la Figura 2.

4. Observaciones finales

La actividad de la proteasa es esencial para muchos sistemas y procesos biológicos. En los parásitos, las proteasas son esenciales para la degradación del tejido del huésped, la evasión inmunitaria y la adquisición de nutrientes [94]. Hasta hace menos de veinte años, se desconocía la presencia y el papel biológico de los proteasomas en los parásitos.

Desde el primer informe de proteasomas en protozoos [63], la primera descripción de su función biológica [73] y la primera descripción de la existencia del proteasoma 26S en protozoos [74], varios informes han confirmado el papel de los proteasomas en el parásito procesos biológicos como la diferenciación, el ciclo celular, la proliferación y la enquistación. La proliferación y la diferenciación son pasos clave en la colonización del hospedador. Considerando la importancia de los proteasomas en ambos procesos en muchos parásitos diferentes como Tripanosoma, Leishmania, Toxoplasma, y Entamoeba, los proteasomas del parásito podrían servir como factores de virulencia.

A pesar de los muchos fenómenos biológicos parasitarios en los que participa el proteasoma, se desconoce la información relativa a cómo participa el proteasoma en tales fenómenos. No se han identificado la mayoría de las proteínas del parásito que son degradadas por los proteasomas. Los objetivos del proteasoma y las rutas biológicas que involucran a los proteasomas en procesos biológicos clave quedan por aclarar.

Los inhibidores del proteasoma han sido herramientas valiosas de investigación en biología celular a través de la elucidación de importantes procesos biológicos asociados con la ruta de degradación de proteínas ubiquitina-proteasoma. El sistema ubiquitina-proteasoma es un objetivo farmacológico privilegiado para el desarrollo de fármacos debido al tremendo potencial de intervención en múltiples patologías, como el cáncer, las enfermedades neurodegenerativas, las enfermedades inmunitarias y las infecciones. El potencial farmacológico del UPS se reveló después del éxito imprevisto de los inhibidores del proteasoma para el tratamiento de algunas neoplasias hematológicas.

Además, después de que la Administración de Drogas y Alimentos de los EE. UU. Aprobara el bortezomib (Velcade) para el tratamiento del mieloma múltiple recidivante, el proteasoma emergió como una nueva diana terapéutica para diversas patologías. Los programas de descubrimiento de fármacos en la academia y la industria farmacéutica han desarrollado una gama de inhibidores del proteasoma 20S sintéticos y naturales de bajo nanomolar y los han incluido en ensayos clínicos en humanos como importantes pistas anticancerígenas y antiinflamatorias. El panorama de la terapéutica basada en inhibidores del proteasoma está evolucionando rápidamente, con promesas más allá de la oncología clínica, y representa un ejemplo emocionante de medicina traslacional.

Varias evidencias sugieren fuertemente que la vía ubiquitina-proteasoma es también una diana terapéutica parasitaria viable. Las investigaciones realizadas en los últimos años han demostrado que el proteasoma es un fármaco diana válido para la enfermedad del sueño [72, 95, 96]. Aunque la estructura del proteasoma del tripanosoma se parece a la de su homólogo de mamífero, los complejos enzimáticos difieren entre sí con respecto a la actividad peptidasa, la especificidad del sustrato y la sensibilidad del inhibidor. Además, los análisis enzimáticos han demostrado que las funciones proteasómicas del tripanosoma y de los mamíferos son particularmente sensibles a la inhibición de las actividades similares a tripsina y quimotripsina, respectivamente [97, 98]. Por tanto, los compuestos que se dirigen específicamente a la actividad similar a la tripsina del proteasoma del tripanosoma pueden constituir una base para el desarrollo racional de fármacos antitripanosomales. Sin embargo, la aparición y propagación de P. falciparum La resistencia a los antimaláricos existentes requiere la búsqueda de nuevos fármacos dianas y compuestos quimioterapéuticos. La inhibición del proteasoma es una estrategia prometedora para desarrollar nuevos fármacos antipalúdicos.

Las enfermedades causadas por parásitos afectan a cientos de millones de personas en todo el mundo, con efectos devastadores para la salud y la economía; sin embargo, los parásitos se han desatendido en gran medida en términos de desarrollo de fármacos porque afectan a las personas pobres de las regiones pobres del mundo. La mayoría de los medicamentos que se utilizan actualmente para tratar estas enfermedades tienen décadas de antigüedad y tienen muchas limitaciones, incluida la resistencia a los medicamentos. Los proteasomas son un orgánulo clave en la biología y virulencia de los parásitos y parecen ser una nueva diana quimioterapéutica atractiva.

Conflicto de intereses

Los autores declaran que no existe ningún conflicto de intereses con respecto a la publicación de este artículo.

Expresiones de gratitud

Los autores agradecen al Sr. You Garmendia por el apoyo en el diseño y elaboración de figuras. Este trabajo fue financiado por el FONDECYT no. 1131007 a Jorge González.

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Derechos de autor

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Conclusiones

Hemos identificado sitios de acetilación en las cinco lisinas en el extremo C-terminal de Cx32. El análisis mutacional de residuos miméticos o deficientes en acetilación demuestra que estas lisinas juegan un papel potencial en la regulación de la ubiquitinación, estabilidad y recambio de Cx32. La inhibición de HDAC6 conduce a la acumulación de proteína Cx32 acetilada, lo que proporciona más pruebas de la modulación de HDAC6 de los niveles de acetilación de Cx32. Un análisis más detallado de los mutantes C-terminales demostró que estos residuos críticos de lisina no alteran las conductancias de unión gap mediadas por Cx32, sino que el estado de acetilación de estas lisinas C-terminales parece regular el recambio de la proteína Cx32 y afectar las funciones independientes del canal, incluidas las células proliferación. Estos resultados resaltan el papel de las lisinas en la cola del terminal C de Cx32 en el ajuste fino de la estabilidad de Cx32 y las funciones independientes del canal.


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