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Secuenciación del producto rtPCR


Así que tengo un conjunto validado de cebadores para rtPCR de Biorad que contiene SYBR green. Si hago rtPCR, ¿puedo usar el producto rtPCR después de purificarlo con un kit de purificación de PCR de Qiagen? Además, tengo la impresión de que la empresa de secuenciación necesita cebadores para realizar la secuenciación, ¿uso simplemente el cebador de PCR o uno de los cebadores "universales" que tiene la compañía?


Puede utilizar el kit de purificación de PCR para limpiar el ADN.

Puede utilizar los cebadores que utilizó para RTPCR para la secuenciación. Los cebadores universales funcionarían solo si la secuencia complementaria está en el extremo 3 'de su amplicón.


Producto de secuenciación de RT-PCR - (14 / Mar / 2013)

Así que tengo un conjunto validado de cebadores para rtPCR de Biorad que contiene SYBR green. Si hago rtPCR, ¿puedo usar el producto rtPCR después de purificarlo con un kit de purificación de PCR de Qiagen? Además, tengo la impresión de que la empresa de secuenciación necesita cebadores para realizar la secuenciación, ¿uso simplemente el cebador de PCR o uno de los cebadores "universales" que tiene la empresa?

¿Por rtPCR se refiere a PCR en tiempo real o transcripción inversa? Si es lo primero, para evitar confusiones es mejor utilizar PCR cuantitativa (qPCR).

Hasta donde yo sé, los cebadores no contienen sybr green, el agente sybr es muy parecido al bromuro de etidio en el sentido de que se basa en la intercalación entre las hebras de ADN a una densidad particular por pb, y como tal sybr se agrega como parte de la mezcla maestra de PCR. Sin embargo, es posible obtener cebadores que estén marcados con fluorescencia (fl), como los cebadores del ensayo Taqman.

En la práctica, no debería importar si los cebadores están etiquetados para su uso en la secuenciación, aunque nunca lo he probado. Sin embargo, puedo imaginar que un cebador etiquetado con Fl puede ocultar la señal de algunas de las llamadas de base iniciales si se usa.

Para la secuenciación, sí, la compañía requiere cebadores, debe configurar un tubo que contenga el ADN objetivo y UN cebador solo; si tiene ambos cebadores en el mismo tubo, obtendrá una señal mixta a medida que las regiones directa e inversa se secuencian simultáneamente (piense en cómo se replica el ADN y la orientación de las dos hebras).

Los cebadores universales son solo para secuenciar plásmidos (e incluso entonces, solo para algunos plásmidos) si su producto no está contenido en un plásmido, necesita suministrar el cebador correcto.

bob1 el viernes 15 de marzo 04:11:59 2013 dijo:

¿Por rtPCR se refiere a PCR en tiempo real o transcripción inversa? Si es lo primero, para evitar confusiones es mejor utilizar PCR cuantitativa (qPCR).

Hasta donde yo sé, los cebadores no contienen sybr green, el agente sybr es muy parecido al bromuro de etidio en el sentido de que se basa en la intercalación entre las hebras de ADN a una densidad particular por pb, y como tal sybr se agrega como parte de la mezcla maestra de PCR. Sin embargo, es posible obtener cebadores que estén marcados con fluorescencia (fl), como los cebadores del ensayo Taqman.

En la práctica, no debería importar si los cebadores están etiquetados para su uso en la secuenciación, aunque nunca lo he probado. Sin embargo, puedo imaginar que un cebador etiquetado con Fl puede ocultar la señal de algunas de las llamadas de base iniciales si se usa.

Para la secuenciación, sí, la compañía requiere cebadores, debe configurar un tubo que contenga el ADN objetivo y UN cebador solo; si tiene ambos cebadores en el mismo tubo, obtendrá una señal mixta a medida que las regiones directa e inversa se secuencian simultáneamente (piense en cómo se replica el ADN y la orientación de las dos hebras).

Los cebadores universales son solo para secuenciar plásmidos (e incluso entonces, solo para algunos plásmidos) si su producto no está contenido en un plásmido, necesita suministrar el cebador correcto.


Gracias por aclarar esto para mí. Sí, me refiero a qPCR. Y no, los cebadores no contienen SYBR green, que es parte de la mezcla maestra, tienes razón. Cometí algunos errores al describir lo que quiero hacer porque es la primera vez que pruebo PCR.

Debe preguntar a la empresa si la matriz SYBR interfiere con sus secuenciadores. La forma más segura de hacerlo sería purificando el producto arrojado a la columna (he usado los de Thermo Fisher - GenJet PCR purification kit) - id hace lo que dice


Secuenciación directa de productos de PCR

Para obtener datos de secuenciación de alta calidad, es muy importante que la reacción de PCR sea específica y fuerte. Si el producto de PCR es un frotis en un gel de agarosa, o hay más de una banda, la probabilidad de obtener buenos datos de secuencia es baja.

Debe eliminar todos los cebadores de PCR y los nucleótidos no incorporados antes de secuenciar el producto. La secuenciación utiliza solo un cebador en lugar de los dos utilizados en la PCR. Si no elimina ambos cebadores, obtendrá dos secuencias superpuestas entre sí que no son legibles.

Está bien utilizar un cebador de PCR para la secuenciación siempre que coincida con nuestras condiciones. Por favor mira Directrices de imprimación para más información.

Verifique la concentración de PCR con un gel de agarosa analítico. La concentración excesiva de su plantilla no le dará una secuencia mejor y podría interferir potencialmente con las muestras de investigadores vecinos en el instrumento.

Applied Biosystems tiene un manual útil para la secuenciación de PCR que se puede descargar como archivo PDF. Necesitará Acrobat Reader para completar la descarga.

Otro folleto útil es la Guía de Qiagen para la purificación de plantillas y la secuenciación de ADN.

Las recomendaciones para los folletos técnicos dadas anteriormente de ninguna manera representan un respaldo a los productos ABI o Qiagen.


Conjunto de cebadores universales para la amplificación y secuenciación de los sitios de escisión HA0 de todos los virus de la influenza A

El análisis de secuencia del sitio de escisión endoproteolítica dentro de la proteína precursora de hemaglutinina (HA) HA (0) es fundamental para los estudios de la biología molecular de los virus de la influenza A, en particular, para el patotipado molecular de los aislamientos de subtipo H5 y H7. Un problema actual para los diagnósticos de rutina es la aparición de nuevas cepas del subtipo H5 o H7 o incluso de otros subtipos que escapan a la detección mediante los protocolos de PCR de transcripción inversa (RT-PCR) de uso común. Aquí, se informa el primer ensayo de RT-PCR pan-HA (PanHA) dirigido al sitio de escisión HA (0) de los virus de la influenza A de los 16 subtipos de HA. El ensayo se evaluó en comparación con las RT-PCR específicas de subtipo H5 y H7 para el sitio de escisión de HA (0) y una RT-PCR en tiempo real que detecta el gen M. Se utilizó un panel de 92 virus de influenza A para la validación. Los datos de secuencia para los virus de la influenza A de 32 muestras de líquido alantoideo y 11 muestras de hisopos de diagnóstico de los 16 subtipos de HA se generaron mediante la secuenciación directa de los productos PanHA RT-PCR. Los resultados demuestran que el nuevo ensayo PanHA RT-PCR, seguido de secuenciación cíclica, puede complementar los métodos existentes y fortalecer la confiabilidad de los diagnósticos del virus de la influenza A, permitiendo tanto la tipificación molecular (H5 y H7) como la subtipificación (no H5 o - H7) dentro de un único enfoque.


RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Mediante la estrategia computacional de RNomics, los estudiantes han identificado alrededor de 80 snoRNA con características estructurales típicas de la familia de snoRNA box C / D de N. crassa, C. glabrata, D. hansenii, K. lactis, y Y. lipolytica. El análisis computacional mostró que estos snoRNAs existen en forma de grupo único o de genes y muestran diversas organizaciones genómicas en diferentes hongos. La mayoría de los snoRNA de C. glabrata y K. lactis snoRNA se transcriben de forma independiente, mientras que snoRNA de N. crassa, D. hansenii, y Y. lipolytica estaban anidados dentro de los intrones de los genes del huésped.

En el laboratorio, los estudiantes funcionaron individualmente. Cada estudiante seleccionó un snoRNA o un grupo de snoRNA para completar su experimento. Al principio, los estudiantes aislaron el ARN total de estos hongos. Utilizando el método mencionado anteriormente, todos los estudiantes obtuvieron 250-300 μg de ARN total de 10 ml de cultivo de células fúngicas. Las proporciones A260 / A280 de las preparaciones de ARN fueron 1,85–1,98, lo que ilustra un ARN de buena calidad con respecto a la pureza. Además, la electroforesis en gel desnaturalizante de agarosa formaldehído mostró tres bandas distintas y la banda de rRNA 25S fue significativamente más intensa que la banda de rRNA 18S, lo que indica que los RNA extraídos de hongos estaban completamente intactos y no se produjo degradación del RNA. Los resultados de dos geles de estudiante se muestran en la Fig.1.

Análisis de electroforesis del ARN total de hongos. Carril 1, ARN total de N. crassa. Carril 2, ARN total de D. hansenii. Los ARNr de 25S, 16S y 5.8S son muy visibles en el gel.

Luego, los estudiantes realizaron RT-PCR para analizar la expresión de snoRNA. La mayoría de los estudiantes obtuvieron productos de RT-PCR. Para los estudiantes que no pudieron obtener productos de RT-PCR, los instructores tenían estudiantes que tuvieron éxito en compartir sus productos para que todos los estudiantes pudieran continuar progresando en el proyecto. La Figura 2 muestra los resultados de un estudiante. El estudiante analizó un grupo de genes snoRNA ubicado en una cepa antisentido de un gen de proteína putativo en N. crassa genoma por RT-PCR. Dado que el gen contiene dos intrones (Fig.2a) según el software de análisis, los productos de RT-PCR deben contener tres bandas. Como era de esperar, los productos de RT-PCR de N. crassa El ARN total, con el par de cebadores P1 / P2, se componía de tres bandas, la más grande (511 pb) de las cuales coincidía con las secuencias del producto de PCR de N. crassa El ADN genómico, el producto de RT-PCR más pequeño (120 pb) correspondía a una transcripción empalmada que carece de dos secuencias intrónicas, y la del medio era el intermedio de empalme, en el que se ha eliminado un intrón (Fig.2B). La clonación y secuenciación de los tres productos de RT-PCR verificaron la aparición de transcritos maduros y empalmes intermedios de los que se eliminaron los intrones en la posición exacta prevista (Fig. 3). Los resultados anteriores mostraron que el análisis computacional de los sitios de empalme es correcto y que el ARN preparado por el estudiante está completamente intacto, con lo cual se pueden obtener todos los productos expresados, incluidos los precursores, los intermedios de empalme y la transcripción de empalme madura de un gen.

análisis de secuencia flanqueante de grupo de genes snoRNA y RT-PCR. (a) snR55 y snR61 secuencia de flanqueo de N. crassa. Las regiones codificantes para snoRNA están sombreadas, los exones del RNA no codificante están en mayúsculas, el intrón está en minúsculas, los sitios de corte y empalme y las secuencias donante / aceptora (recuadradas) están indicadas. Las flechas marcan las ubicaciones de los cebadores utilizados para el análisis de RT-PCR. (B) Análisis de RT-PCR. Carril 1, RT-PCR, después de la transcripción inversa de N. crassa ARN total con el cebador P1, se realizó PCR con el par de cebadores P1 / P2. El pequeño producto de RT-PCR (120 pb) corresponde a la transcripción empalmada. El precursor no empalmado de la transcripción (511 pb) también es detectable. Carril 2, control de ADN, PCR de N. crassa El ADN genómico con el producto de PCR predicho por el par de cebadores P1 / P2 es de 511 pb. Carril 3, control de PCR, PCR de N. crassa ARN total con el par de cebadores P1 / P2.

La secuencia del producto de RT-PCR corresponde a la transcripción empalmada del grupo de genes snoRNA. La posición del intrón eliminado se indica con una punta de flecha. (a) Detección de eliminación del primer intrón de un intermedio de empalme. (B) Detección de eliminación de los segundos intrones de un intermedio de empalme.

En resumen, este procedimiento de laboratorio representa un método eficaz y consistente para preparar a los estudiantes avanzados para participar en la investigación. Este procedimiento introduce a los estudiantes al concepto de RNomics, ARN no codificante y empalme de ARN, a la aplicación de bases de datos biológicas y herramientas bioinformáticas, y a la práctica de técnicas moleculares básicas. Creemos que el procedimiento debería ser aplicable para estudiar otros ARN no codificantes sin mucha modificación.


Secuenciación directa de productos de RT-PCR del virus de la hepatitis A y norovirus de ostras contaminadas con el medio ambiente utilizando cebadores de cola M13

El norovirus humano (HuNoV) y la hepatitis A (HAV) son reconocidos como las principales causas de enfermedades no bacterianas asociadas a los alimentos en los Estados Unidos. La secuenciación del ADN generalmente se considera el estándar para la determinación del genotipo viral preciso en apoyo de las investigaciones epidemiológicas. Debido a la diversidad genética de los norovirus (NoV), los conjuntos de cebadores degenerados se utilizan a menudo en la PCR convencional con transcripción inversa (RT) y la RT-PCR cuantitativa en tiempo real (RT-qPCR) para la detección de estos virus y los fragmentos de ADNc generalmente se clonan antes de la secuenciación. Los métodos de detección del VHA que son sensibles y específicos para RT-qPCR en tiempo real producen fragmentos pequeños de 89-150 pb, que pueden ser difíciles de secuenciar. Para superar estos obstáculos, los cebadores de norovirus y HAV se combinaron con cebadores directos e inversos de M13. Esta modificación aumenta el tamaño del producto secuenciado y permite la secuenciación directa de los amplicones utilizando cebadores M13 complementarios. Los productos de cDNA de HuNoV y HAV de ostras contaminadas con el medio ambiente se analizaron utilizando este método. Las alineaciones de las muestras secuenciadas revelaron identidades de nucleótidos ≥95%. Los cebadores de cola NoV y HAV con secuencia M13 aumenta el tamaño del producto de ADNc, ofrece una alternativa a la clonación y permite una secuenciación rápida, precisa y directa de los productos de ADNc producidos por ensayos RT-qPCR convencionales o en tiempo real.


Productos NEBNext & reg ARTIC para secuenciación del SARS-CoV-2

Especialmente con el surgimiento continuo de variantes del SARS-CoV-2 que afectan la transmisión del virus y otras métricas importantes para la salud pública, existe una necesidad creciente de métodos confiables, precisos y rápidos para secuenciar el SARS-CoV-2. Los kits NEBNext ARTIC se basan en el trabajo original de ARTIC Network, que rápidamente adaptó sus protocolos al SARS-CoV-2 (Josh Quick 2020. Protocolo de secuenciación nCoV-2019 v2 (GunIt)).

El método ARTIC es un enfoque de secuenciación del genoma viral completo basado en amplicones multiplexados (Figura 1), y las opciones del kit NEBNext ARTIC son compatibles con las plataformas de secuenciación de Illumina y Oxford Nanopore Technologies. Los dos kits compatibles con la secuenciación de Illumina generan insertos de biblioteca de

400 pb, para secuenciación de 2 x 75 o 2 x 250, respectivamente (Figura 2). El módulo NEBNext ARTIC SARS-CoV-2 RT-PCR contiene solo los reactivos necesarios para la síntesis de ADNc y la amplificación de ADNc dirigida a partir del ARN genómico del SARS-CoV-2.

Figura 1: Descripción general del flujo de trabajo ARTIC de NEBNext

Para flujos de trabajo más detallados, use los enlaces a continuación:

Figura 2: Opciones del kit NEBNext ARTIC



Los kits NEBNext ARTIC incluyen grupos de cebadores V3 ARTIC, que se han equilibrado utilizando la metodología desarrollada en NEB basada en datos empíricos de secuenciación. Estos cebadores equilibrados proporcionan una mayor uniformidad de la cobertura del genoma (Figura 3) de 10 a 10.000 copias del genoma del SARS-CoV-2. Los reactivos para RT-PCR y preparación de bibliotecas están optimizados para el flujo de trabajo ARTIC de SARS-CoV-2.

Figura 3: Se requieren menos lecturas para cubrir completamente el genoma con el kit complementario NEBNext ARTIC SARS-CoV-2 (Oxford Nanopore Technologies)

Visualización integral del visor del genoma de la cobertura de lectura en todo el genoma del SARS-CoV-2. Los amplicones se generaron a partir de 1000 copias de entradas de ARNg viral del SARS-CoV-2 (ATCC VR-1986 y VR-1991) en 100 ng de ARN de referencia humano universal (ThermoFisher QS0639) utilizando el panel IDT ARTIC nCoV-2019 V3 (& ldquoStandard & rdquo) o el Grupos de imprimación equilibrada NEBNext ARTIC SARS-CoV-2. Las bibliotecas se construyeron utilizando el kit complementario NEBNext ARTIC SARS-CoV-2 (Oxford Nanopore Technologies) y los kits de expansión de códigos de barras nativos de Oxford Nanopore Technologies 1-12 (EXP-NBD104) y 13-24 (EXP-NBD114), kit de secuenciación de ligadura ( SQK-LSK109) y el kit de expansión SFB (EXP-SFB001). La secuenciación se realizó en un instrumento GridION utilizando celdas de flujo R9.4.1. Se utilizó Minimap2 con 24500 lecturas o datos 250x para el mapeo contra SARS-CoV-2 Wuhan-Hu-1.

Figura 4: Cobertura del genoma en una amplia gama de cantidades de entrada, con el kit de preparación de biblioteca NEBNext ARTIC SARS-CoV-2 FS (Illumina)

Los amplicones se generaron a partir de 1.000 copias de entradas de ARNg viral del SARS-CoV-2 (ATCC VR-1986 y VR-1991) en 100 ng de ARN de referencia humano universal (ThermoFisher QS0639) utilizando grupos de cebadores ARTIC SARS-CoV-2 balanceados NEBNext, con o sin pares de imprimaciones de control humano NEBNext ARTIC. Las bibliotecas se construyeron utilizando el kit de preparación de bibliotecas NEBNext ARTIC SARS-CoV-2 FS (Illumina) y se secuenciaron en un instrumento MiSeq (2x75 pb). La fracción del genoma cubierta en cada profundidad se determinó para un rango de entradas y lecturas muestreadas a 10,000, 100,000, 500,000 y 1,000,000.

Las condiciones de reacción de RT son las mismas para todas las cantidades de entrada, y para las aplicaciones de Illumina, una nueva formulación de ADN polimerasa para el enriquecimiento de bibliotecas de secuenciación de próxima generación elimina la necesidad de normalizar las concentraciones de amplicones antes de la preparación de la biblioteca.

  • Uniformidad mejorada de la profundidad de cobertura del genoma del SARS-CoV-2
  • Protocolos optimizados y de alta eficiencia
  • Efectivo con una amplia gama de entradas del genoma viral (10-10,000 copias)
  • Disponible para plataformas de secuenciación Illumina y Oxford Nanopore Technologies
  • Condiciones de RT único para todas las cantidades de entrada
  • No se requiere normalización de amplicones antes de la preparación de la biblioteca (kits compatibles con Illumina)
  • Se proporcionan cebadores humanos de control de uso opcional
  • Incluye perlas de purificación de muestras NEBNext (SPRIselect & reg)
  • Adaptadores de biblioteca y cebadores disponibles por separado

Lea lo que dicen los líderes en secuenciación ARTIC SARS-CoV-2

El kit complementario NEBNext ARTIC SARS-CoV-2 (Oxford Nanopore Technologies) proporcionará a los investigadores la forma más conveniente de realizar la secuenciación de nanoporos del SARS-CoV-2. Al desarrollar el protocolo ARTIC, nos hemos centrado en la recuperación de genomas casi completos a partir de muestras clínicas desafiantes con & ltCt33. Adoptamos un enfoque de amplicón en mosaico de 400 pb porque proporciona un rendimiento sólido en una amplia gama de entradas, incluidas muestras de alto Ct y ARN degradado que se encuentran a menudo. El flujo de trabajo de códigos de barras nativos proporciona amplicones de longitud completa compatibles con las mejores prácticas de demultiplexación y creación de consenso basado en referencias, mientras que la preparación de la biblioteca sin PCR minimiza el riesgo de contaminación por amplicones. Hemos trabajado en colaboración con NEB para optimizar el protocolo para minimizar los volúmenes de reactivos mientras mejora el rendimiento y esto ahora también se beneficia de los grupos de cebadores optimizados que mejoran en gran medida la integridad del genoma y reducen los requisitos de cobertura de lectura. La compatibilidad con el kit de expansión de código de barras nativo de 96 códigos de barras permite la flexibilidad de ejecutar entre 24 y 96 muestras, según sus requisitos.

- Joshua Quick, Ph.D., de la Universidad de Birmingham y ARTIC Network

Nos ha impresionado el gran rendimiento del kit NEBNext ARTIC FS en nuestra secuenciación de muestras humanas que contienen ARN del SARS-CoV-2. Con este kit hemos estado procesando con éxito muestras de diversa calidad y cantidad y nos ha sorprendido su sensibilidad y notable uniformidad de la cobertura del genoma viral. El rápido tiempo de respuesta del sólido flujo de trabajo ha sido realmente beneficioso para nosotros.

- Vladimir Benes, director de las instalaciones básicas de genómica del Laboratorio Europeo de Biología Molecular

El kit de preparación de bibliotecas NEBNext ARTIC SARS-CoV-2 FS garantiza una determinación rápida, precisa y confiable del genoma completo del SARS-CoV-2. Debido a su facilidad de uso, el kit de preparación de bibliotecas NEBNext ARTIC SARS-CoV-2 FS permite una rápida integración en el flujo de trabajo rutinario de NGS. Además, el kit sigue funcionando de forma robusta con muestras clínicas difíciles (ct & gt30). Recomendaría 100% el kit de preparación para bibliotecas NEBNext ARTIC SARS-CoV-2 FS.


Las plantillas de ADN bicatenario se desnaturalizan a una temperatura determinada en parte por su contenido de G + C. Cuanto mayor sea la proporción de G + C, mayor será la temperatura requerida para separar las hebras de ADN molde. Cuanto más largas sean las moléculas de ADN, mayor será el tiempo necesario a la temperatura de desnaturalización elegida para separar las dos hebras por completo. Si la temperatura para la desnaturalización es demasiado baja o si el tiempo es demasiado corto en las regiones ricas en AT de la plantilla, se desnaturalizará el ADN. Cuando la temperatura se reduce más adelante en el ciclo de PCR, el ADN molde se volverá a recocer en una condición completamente nativa. En las PCR catalizadas por la polimerasa Taq, la desnaturalización se lleva a cabo a 94-95 o C, que es la temperatura más alta que la enzima puede soportar durante 30 o más ciclos sin sufrir un daño excesivo. En el primer ciclo de PCR, a veces se lleva a cabo la desnaturalización durante 5 minutos para aumentar la probabilidad de que las moléculas largas de ADN molde se desnaturalicen por completo. Sin embargo, este período prolongado de temperatura de desnaturalización es innecesario para las moléculas de ADN lineal, ya que a veces puede ser perjudicial. La desnaturalización durante 45 segundos a 94-95 ° C se utiliza de forma rutinaria para amplificar moléculas de ADN lineal cuyo contenido de GC es & lt55% y una temperatura más alta para ADN molde y / o diana cuyo contenido de GC es & gt55%. En tales casos, se prefieren polimerasas mucho más tolerantes al calor.

La temperatura utilizada para el paso de recocido es crítica. Si la temperatura de hibridación es demasiado alta, los cebadores de oligonucleótidos se hibridan mal, si es que lo hacen, con el molde y el rendimiento de ADN amplificado es muy bajo. Si la temperatura de hibridación es demasiado baja, puede producirse una hibridación no específica de los cebadores, lo que da como resultado la amplificación de segmentos de ADN no deseados. El recocido se lleva a cabo habitualmente de 3 a 5 ° C por debajo de la temperatura de fusión calculada a la que los cebadores de oligonucleótidos se disocian de sus moldes. Existen muchas fórmulas para determinar la Tm teórica, pero ninguna de ellas es precisa para cebadores de oligonucleótidos para todas las longitudes y secuencias. Es mejor optimizar las condiciones de hibridación realizando una serie de PCR de prueba a temperaturas que oscilan entre 2 ° C y 10 ° C por debajo de la temperatura de fusión más baja calculada para los dos cebadores de oligonucleótidos. Alternativamente, el termociclador se puede programar para usar temperaturas de recocido progresivamente más bajas en pares consecutivos de ciclos (PCR "touchdown". En lugar de examinar una variedad de condiciones de recocido en PCR separadas, la optimización se logra exponiendo una sola PCR a una serie secuencial de temperaturas de recocido en ciclos sucesivos de la reacción.

Extensión de cebadores de oligonucleótidos se lleva a cabo en o cerca de la temperatura óptima para la síntesis de ADN catalizada por la polimerasa termoestable, que en el caso de la polimerasa Taq es 72-78 o C.En los dos primeros ciclos, la extensión de un cebador avanza más allá de la secuencia complementaria a la unión sitio de la otra cartilla. En el siguiente ciclo, se producen las primeras moléculas cuya longitud es igual al segmento de ADN delimitado por los sitios de unión de los cebadores. A partir del tercer ciclo, este segmento de ADN se amplifica geométricamente, mientras que los productos de amplificación más largos se acumulan aritméticamente. La tasa de polimerización de la polimerasa Taq es

2000 nucleótidos / minuto a la temperatura óptima (72-78 o C) y como regla general se realiza la extensión durante 1 minuto por cada 1000 pb de producto. Para el último ciclo de PCR, muchos investigadores utilizan un tiempo de extensión que es 3 veces más largo que los ciclos anteriores, aparentemente para permitir la finalización de todos los productos amplificados.


Introducción

Descripción general de las estrategias de secuenciación de alto rendimiento

La estrategia basada en la escopeta, la técnica de preferencia para secuenciar genomas de ADN grandes, se ha utilizado para la caracterización completa del genoma de una variedad de eucariotas y procariotas 1,2,3,4,5,6. El ADN genómico se corta en fragmentos de 2 a 50 kpb. Los extremos 2, 3 'y 5' se reparan y se clonan en un vector bacteriano para producir una biblioteca. Las regiones terminales de 700 pb de estos clones se secuencian con cebadores de vector independientes del inserto 7, y la secuencia completa se reconstruye a partir de fragmentos superpuestos. Los proyectos de secuenciación a gran escala han impulsado las mejoras técnicas recientes para reducir el costo y el tiempo necesarios para obtener una resolución de secuencia única. Estos avances consisten principalmente en alternativas a la creación de bibliotecas bacterianas ya la bioquímica de secuenciación de Sanger 8. Por lo tanto, recientemente se han desarrollado procedimientos de secuenciación integrados que incluyen la producción de bibliotecas, la amplificación de ADN, la secuenciación y el ensamblaje de contig 9,10. Estas tecnologías aún se basan en el cizallamiento aleatorio del ADN, pero permiten la separación de moléculas de plantilla individuales en perlas y su amplificación independiente en un sistema libre de células mediante PCR en emulsión 11. La secuenciación se realiza posteriormente en cada perla, utilizando pirosecuenciación 12 o secuenciación por ligación 10 en lugar del método tradicional de Sanger.

Sin embargo, el uso de tales canales de secuenciación integrados parece inapropiado cuando se aplica a la genómica del virus de ARN. En primer lugar, los virus son pequeños parásitos intracelulares para los que se deben separar grandes cantidades del material genético objetivo de los ácidos nucleicos del huésped para construir la biblioteca. Esto requiere pasos preliminares de cultivo de tejidos y ultracentrifugación antes de cortar y clonar 13. Además, los rendimientos requeridos de ácidos nucleicos son difíciles de obtener cuando se trabaja con virus de ARN y / o virus de baja replicación. Esta estrategia requiere mucho tiempo, es difícil en el caso de muestras clínicas y es peligrosa para los patógenos humanos. En segundo lugar, los genomas de ARN viral suelen ser pequeños y / o segmentados (moléculas de 1 a 10 kpb). En tercer lugar, los genomas del virus de ARN consisten con frecuencia en motivos conservados cortos intercalados con regiones largas que muestran altos niveles de heterogeneidad genética. Por lo tanto, una estrategia de secuenciación común consiste en amplificar y secuenciar productos de PCR largos obtenidos utilizando cebadores dirigidos a las regiones más conservadas. Por estas razones, la genómica estándar del ARN viral se ha basado en amplificaciones de RT-PCR de 1 a 5 kpb seguidas de la marcha del cebador, que implica de novo síntesis de cebadores específicos para extender la secuenciación a regiones indeterminadas. La caracterización de una secuencia de 4 kpb por este método requiere al menos seis rondas de secuenciación. El diseño y la síntesis de nuevos cebadores hacen que esta estrategia sea costosa y requiera mucho tiempo.

Los procedimientos alternativos se pueden dividir en tres grupos. El primero consiste en sustituir la bioquímica de secuenciación de Sanger por tecnologías más baratas y rápidas, como la pirosecuenciación o la secuenciación por ligación-hibridación. Sin embargo, su longitud de lectura corta, limitada a 100 pb, está mal adaptada a la secuenciación de alto rendimiento de genomas cortos. La segunda alternativa evita de novo síntesis de cebadores mediante el uso de una biblioteca de oligonucleótidos prefabricada. Los cebadores pueden ser: (i) oligonucleótidos de 5 a 10 meros sintetizados aleatoriamente que se utilizan solos 14,15,16 o en una combinación modular 17,18,19,20,21,22 o (ii) oligonucleótidos resultantes de síntesis de alto rendimiento 23,24. Hasta la fecha, el tamaño de las bibliotecas de oligonucleótidos requeridas limita el uso de estos métodos. Recientemente se ha propuesto el método indexer walking 25: el ADN se somete a ciclos de digestiones seguidas de la ligadura terminal de adaptadores de oligonucleótidos ("índice"). Un extremo del ADN clonado se secuencia con el cebador universal M13, y esta primera secuencia se analiza para encontrar sitios de restricción de endonucleasas específicos cerca de su extremo 3 '. El ADN se digiere con la enzima seleccionada antes de la ligación de un indexador bicatenario específico, se amplifica por PCR y se envía a secuenciación Sanger cebada con el indexador. Estos pasos se repiten y permiten el progreso unidireccional hacia la secuencia desconocida. Como la biblioteca indexadora es considerablemente más pequeña que las propuestas anteriormente, la caminata indexadora podría ser un método rentable ya que evita la síntesis sistemática de cebadores. Sin embargo, el procedimiento sigue siendo lento por las siguientes razones: (i) la elección del indexador es una función de la secuencia de nucleótidos determinada en el ciclo anterior y (ii) el manejo experimental para un solo ciclo de digestión-ligación implica la amplificación del ADN y Purificación de ADN mediante purificación en gel, precipitación con etanol y perlas recubiertas de estreptavidina.

Descripción general de la técnica LoPPS

La tercera alternativa utiliza la estrategia de la escopeta para crear, a partir de un producto de PCR, una biblioteca de ADN de fragmentos lo suficientemente cortos como para permitir la secuenciación completa en un solo paso. Una de las principales ventajas de la estrategia de la escopeta es el potencial de automatización de todo el proceso. La automatización del crecimiento bacteriano, la purificación y secuenciación del ADN plasmídico permite la secuenciación rápida de numerosos genomas de ADN grandes a estándares de alta calidad con atractivos perfiles de costos. Hemos desarrollado el procedimiento de secuenciación de productos de PCR larga (LoPPS) (ver Fig. 1) sobre la base de esta estrategia de escopeta. Los productos de PCR de tres a cinco kilopares de bases, generados por cualquier método estándar de PCR o RT-PCR, se cortan aleatoriamente por ultrasonido en fragmentos de ADN de ∼ 700 pb. Los extremos que sobresalen se reparan para crear extremos romos y se añaden salientes A 3 'para permitir la clonación de TA y evitar la concatenación de fragmentos. El número de clones necesarios para la reconstrucción de contig se predice a partir de la longitud del producto de PCR inicial (ver Tabla 1 y ref. 36). Los clones se seleccionan aleatoriamente y se secuencian con el cebador de vector T7 PROM. Finalmente, la secuencia objetivo se reconstruye a partir de fragmentos superpuestos.


Información de soporte

S1 Fig. Preprocesamiento de datos SCAN-seq y control de calidad.

(A) Esquema de los pretratamientos de datos de SCAN-seq (para obtener más detalles, consulte Métodos). (B) La distribución de la longitud de los productos de ADNc antes de la construcción de la biblioteca. (C, D) Distribución de la longitud de las lecturas completas. Los datos numéricos se enumeran en S2 Data. SCAN-seq, amplificación unicelular y secuenciación de ARN completos mediante la plataforma Nanopore.

S2 Fig. Calidad de datos de mESCs usando SCAN-seq.

(A) Curva de saturación de genes e isoformas detectados en mESC. (B) Mapa de calor del valor de correlación (Pearson) entre cada par de mESC. El valor de correlación de mESC por SCAN-seq fue incluso mejor que el de SUPeR-seq y el método Tang 2009. (C) Cobertura de lecturas a lo largo de todas las transcripciones. (A – C) Los datos numéricos se enumeran en Datos S2. mESC, SCAN-seq de células madre embrionarias de ratón, amplificación de células individuales y secuenciación de ARN de longitud completa mediante la plataforma Nanopore SUPeR-seq, secuenciación de ARN independiente de poli (A) universal de una sola célula.

S3 Fig. Curva de saturación de genes e isoformas detectados en células en diferentes etapas de desarrollo.

Los datos numéricos se enumeran en S2 Data.

S4 Fig. Análisis de expresión génica en muestras embrionarias de ratón.

(A) Número de genes detectados en cada célula individual en cada etapa / tipo de desarrollo. Los datos numéricos se enumeran en S2 Data. (B) Correspondencia de genes específicos de etapa detectados usando SCAN-seq y SUPeR-seq. (C) Análisis de GO del grupo 6 de genes en la Fig 3D. GO, ontología genética SCAN-seq, amplificación unicelular y secuenciación de ARN de longitud completa mediante la plataforma Nanopore SUPeR-seq, secuenciación de ARN unicelular universal poli (A) independiente.

S5 Fig. LncRNA detectados en embriones de ratón antes de la implantación.

(A) La relación de lecturas de mESC y todos los blastómeros en diferentes etapas de desarrollo. El centro representa la media y las barras de error representan el SEM. (B) Mapa de calor que muestra los niveles de expresión de LncRNA en todas las células. (A, B) Los datos numéricos se enumeran en Datos S2. lncRNA, ARN largo no codificante mESC, SEM de células madre embrionarias de ratón, error estándar de la media.